昆明小鼠放射性肺炎病理观察

杨 钤 冯玛莉 朱丽娜 仝立国

(山西省中医药研究院临床药理研究室，太原 030002)

放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗、骨髓移植等预处理后常见的并发症，严重时加速患者死亡[1]。病程可分为早期急性肺炎和晚期放射性肺纤维化2期[2]。本研究模拟临床放疗条件，制备昆明小鼠放射性肺炎模型，阐明疾病发生发展过程肺部病理变化，为中药治疗奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 样本(对象)选择及分组

昆明小鼠，雌雄各半，5周龄，体质量为(20±2)g，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：[SCXK(京)2014-0004]。动物饲养条件：同时分笼饲养于山西省中医药研究院中心实验室，自然光照，自由进水，室内温度18～29 ℃，湿度36%～60%。

将实验小鼠随机分为4组：空白对照组以及模型组照射后7th、14th、28th 3组。每组10只，雌雄各半。

1.2 模型制备

动物经3%戊巴比妥麻醉后，采用6MV的X射线20Gy单次全胸照射(图1)造模，照射位置为头部下方、剑突以上，照射野面积2 cm×3 cm，剂量率：2 Gy/min，放射源距皮100 cm。空白组不做任何处理。

图1 6MV的X射线20Gy单次全胸照射， 放射源距皮100 cmFig.1 20 Gy cumulative dose of 6MV X-ray irradiation of full chest once, and source-skin distance=100 cm

1.3 取材及常规病理观察

分别于照射后第7、14、28天后杀检取材，肺脏经宏观观察后，与心脏一起包入纱布中置于10%中性甲醛溶液进行固定。取左肺叶和右肺中叶，常规脱水、石蜡包埋、切片后，经HE染色后显微镜下观察肺脏组织病理学形态改变。

1.4 HE染色步骤

二甲苯I-1 10 min→二甲苯I-2 10 min→二甲苯I-3 10 min→无水乙醇I 5 min→95%乙醇 I 5 min→75%乙醇I 5 min→苏木素 4 min→自来水清洗→0.5%盐酸 5 s→自来水清洗→1%氨水 5 s→自来水清洗→伊红 2 min→75%乙醇II 5 s→85%乙醇 5 s→95%乙醇II 5 s→无水乙醇II 10 min→二甲苯II-1 10 min→二甲苯II-2 10 min→二甲苯II-3 10 min[3]。

1.5 图像分析

采用Image Pro Plus图像分析系统检测组织切片中肺泡壁厚度、肺泡腔面密度(肺泡腔面积/视野单位面积)、肺间质面密度(肺间质面积/视野单位面积)[4]。每张切片随机选取5个视野测量。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 照射后KM小鼠临床表现

照射3 d后，KM小鼠背部胸段照射野被毛脱落，状态萎靡。

2.2 组织病理学形态变化

空白对照组肺实质与间质部分病理组织学结构均正常(图2-A)。模型组照射7 d后可见轻度肺炎，肺泡间隔增宽、少量炎细胞浸润(图2-B)。照射14 d后表现为轻-中度肺炎，肺泡塌陷，炎细胞浸润肺泡间隔，破坏肺泡结构，轻度渗出(图2-C)。照射4周后可见重度肺炎，肺泡塌陷实变，炎细胞大量浸润，轻度纤维化改变，毛细血管充血，气管支气管上皮杂乱、脱落(图2-D)。

图2 组织病理学形态变化 HE ×100注：A： 空白对照组；B： 20Gy照射后7 d；C： 20Gy照射后14 d；D： 20Gy照射后4周Fig.2 Lung histopathological changes HE×100Note:A: Blank control group; B: 7 d after 20Gy irradiation; C: 14 d after 20Gy irradiation; D: 4 weeks after 20Gy irradiation

2.3 定量测定

正常对照组与模型组肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺间质面密度变化见表1。照射20Gy后，随时间延长，肺泡壁增厚，第7、14、28天测量结果差异显著(P<0.01)；肺泡腔萎缩，面积减小，第7天后差异显著(P<0.05)，第14、28天后差异极显著(P<0.01)；肺间质增宽，面积增大，第14、28天后测量差异极显著(P<0.01)。

表1 肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺间质面密度测量结果Table 1 The determination of thickness of alveolar walls and surface mass density of alveolar spaces and interstitial tissue

注：*P<0.05；**P<0.01

Note：*P<0.05 vs control,**P<0.01 vs control

3 讨论

放射性肺炎系由肺癌、食管癌、乳腺癌或胸部其他恶性肿瘤经放射治疗后,在放射野内的正常肺组织受到损伤而引起的炎症反应，该病的发生率为5%～50%，严重肺炎发生率为10%～20%，病死率高达50%[5]。尽管近年来治疗手段不断进步,尤其是中医辨证治疗放射性肺炎具有较好的疗效[6]，但是该病的发生率仍高达30%。放射性肺炎的发生发展对机制研究及防治措施的优化至关重要，综合遗传背景、研究费用及操作难易程度等因素，选择昆明种小鼠作为实验动物[7-8]。模拟临床放疗条件建立放射性肺炎模型，阐明放射性肺炎发生发展过程的病理变化。

参照周仟等、白蕴红等[9-10]方法，采用6MV的X线单次大剂量20Gy照射复制小鼠放射性肺损伤模型，分别于照射后第7、14、28天，观察小鼠一般体征，并进行病理HE染色观察。射线照射3 d后出现活动减少、精神萎靡、体质量减轻、胸背部脱毛等状况。此外，随着观察时间的延长，肺泡，肺间质均出现进行性病变，通过实验发现，6MV的X线20Gy辐照对肺部病变有明显影响。昆明小鼠辐照第7天后，肺间质增宽，炎细胞轻度浸润；辐照第14天后，肺泡塌陷，肺间质进一步增厚，炎细胞浸润明显，红细胞轻度渗出，表明肺部病变已初步出现；而辐照第28天后，肺泡萎缩实变，炎细胞大量浸润，毛细血管充血，气管支气管上皮杂乱、脱落，出现轻度纤维化改变，表明肺部病变已经非常明显。此外，通过统计学定量分析结果，显示辐照第14、28天后肺泡壁厚度、肺泡腔面积、肺间质面积变化极显著(P<0.01)。本次实验主要偏向于从宏观、表观方向选择表征放射性肺炎病变的关键指标，如肺泡壁厚度、肺泡腔面积、肺间质面积等进行观察描述，下一步应从分子生物学角度对放射性肺炎的病理机理予以进一步观察和验证。综上所述，病理学研究结果符合放射性肺炎的病变规律[8]，可用于进一步药理研究。