RT-qPCR检测Wistar大鼠黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因 转录水平方法的建立*

王陈芸 李哲丽 叶尤松 蔡发晶 肖 涵 谢季平 唐东红

(1.中国医学科学院/北京协和医学院 医学生物学研究所,昆明 650118)(2. 云南省中医学院,昆明 650200) (3.昆明市科学技术情报研究所，昆明 650600)

黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(xanthine dehydrogenase/oxidase，XDH/XO)是一种嘌呤代谢的氧化过程中的限速酶，在嘌呤代谢过程中催化嘌呤代谢的最后两步，即催化次黄嘌呤和黄嘌呤形成尿酸。XDH/XO基因的分布具有物种和组织特异性，在人体中主要存在于肝脏、小肠和血脑血管中，其基因定位于2号染色体断臂上。灵长类体内尿酸氧化酶失活，尿酸成为嘌呤代谢的终产物[1-3]。当体内XDH/XO基因活性异常增高时，则会生成大量尿酸造成尿酸的沉积，导致血清尿酸浓度升高。女性血尿酸浓度>6.0 mg/dL，男性血尿酸浓度>7.0 mg/dL，即可诊断为高尿酸血症[4]。高尿酸血症不仅是痛风的发病基础，还可造成多种心血管疾病和代谢相关疾病，且其发病率逐年上升，因此备受关注。研究高尿酸血症就要研究其发病机理，所以对XDH/XO基因的研究极其重要，目前多有其组织分布，活性等的研究[5-6]。

实时荧光定量 PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time, RT-qPCR)技术于1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出，RT-qPCR实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与普通 PCR 相比，它具有特异性更强、重复性好、灵敏度高、定量准确、全封闭反应、自动化程度高等优点成为分子生物学研究中的重要工具，目前已得到广泛应用[7]。Wistar大鼠是实验大鼠(Rattusnorregicu,rat)的一个常用品系，其繁殖力强、生长发育快、性情温顺、对传染病的抵抗力较强，是生物医学方面研究的常用实验动物，是目前高尿酸血症动物模型研究中最为常用的实验动物。为研究高尿酸血症模型Wistar大鼠肝脏中XDH/XO基因转录水平的变化，本文采集Wistar大鼠肝脏总RNA，逆转录为DNA，设计引物进行RT-qPCR扩增，建立标准曲线，以在转录水平上对XDH/XO基因进行定量检测。本方法的建立可用于研究高尿酸血症的发病机理以及药物筛选。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar 大鼠12只，雌雄各半，由中国医学科学院医学生物学研究所小动物实验部提供，其生产许可证号：SCXK(滇)K2014-0002。使用许可证号：SYXK(滇)K2014-0007。实验程序符合中国医学科学院医学生物学研究所动物实验伦理委员会的要求，并遵守国际惯例，按照实验动物使用的3R原则给以关怀。

1.2 试剂及仪器

逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)，RT-qPCR扩增试剂盒(SYBR Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus)、RNA提取液(Tripure)，均购自Roche公司；氧嗪酸钾(oxonic aid potassium salt，OA)，购自美国Sigma公司，纯度≥97%；别嘌醇(allopurinol,ALLO)，购自南京都莱生物有限公司，纯度≥98%；羧甲基纤维素钠(Carboxy methyl cellulose sodium，CMC)，购自昆明诚悦科技公司；Biowest 琼脂糖; DNA 分子量标准(DL 2000 bp)，购自TakaRa 生 物 工 程 有 限 公 司。CFX 96 TM real-time system 荧光定量 PCR 仪，购自美国Bio-Rad 公司;凝胶成像分析仪，美国 BioRad 公司; Power Pac Basic 电泳仪，购自北京六一生物工程有限公司; ND-1000 紫外 分光 光 度 计，购自美 国 Dano Drop 公司; 高速冷冻离心机，购自Sigma公司；SCIENTZ-48高通量组织研磨器，购于宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 引物设计及合成

引物设计以NCBI提供的大鼠XDH/XO核苷酸序列(017008.3)为参考，利用Primer5.0软件在CDS区域进行设计。管家基因GAPDH：上游片段5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′下游片段5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，基因片段大小为143 bp；目的基因XDH/XO：上游片段5′-ATGCGGACCCTGAAACAACA -3′下游片段5′-TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA -3′，基因片段大小为114 bp，均由宝生物TaKaRa生物有限公司合成。

1.4 RNA提取

脱颈处死Wistar大鼠，酒精棉球消毒腹部，迅速取出肝脏组织0.1 g于装有1 mL tripure的5 mL EP管中，放入适合大小钢珠，放入高速组织研磨器中充分研磨；静置5 min，液体转移至1.5 mL EP管中静置5 min，加入200 μL -20 ℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15 min后4 ℃，12 000×g离心25 min，吸取上清液450 μL于另一只1.5 mL EP管中，等体积加入-20 ℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10 min，4℃，12 000×g离心10 min，弃上清液，待管内壁稍干，加1 mL -20 ℃预冷的75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃，7 500×g离心5 min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30 μL DEPC水溶解沉淀，65 ℃水浴10 min，得总RNA样品。

1.5 RNA完整性及纯度检测

移取总RNA样品2 μL于1.5%琼脂糖凝胶孔中，在90 V，400 mA的条件下电泳20 min，于凝胶成像分析系统下观察28S、18S 和5S RNA条带，分析 RNA的完整性；再取1 μL于ND-1000紫外分光光度计测定RNA浓度。

1.6 RNA逆转录

测定浓度后每管按比例加DEPC水稀释至1 000 ng/μL；总RNA按照逆转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit说明操作，每10 μL体系中依次加入5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，总RNA 1 μL，RNaseFree dH2O 5.5 μL，逆转录条件为: 37 ℃，15 min，85 ℃，5 s；4 ℃，10 min，逆转录得到cDNA。

1.7 Wistar大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因标准曲线的建立

以Esidilution 为溶剂梯度稀释mDNA，分别稀释为10-1，10-2，10-3,10-4倍浓度，以原始cDNA及稀释后的cDNA为模板，各做2个平行样进行RT-qPCR检测：反应体系为25 μL。分别加XDH/XO基因及GAPDH基因上、下游引物各1 μL(10p)再分别加SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)12.5 μL及灭菌去离子水9.5 μL、cDNA 1 μL。反应条件为：94 ℃预变性30 s, 94 ℃变性5 s、59 ℃退火30 s、40个循环，59 ℃到94 ℃每5s采集一次荧光。反应完成后根据荧光信号的数据，使用CFXManager软件，制作标准曲线，得到基因扩增效率，斜率及R2值，当XDH/XO基因及内参基因GAPDH基因扩增效率在80%至120%之间，R2值接近1，说明结果可信度较高，符合荧光定量 PCR要求。

1.8 OA致Wistar大鼠高尿酸血症动物模型XDH/XO mRNA转录水平检测

6只Wistar大鼠随机分成3组，2只/组，第一组腹腔注射300 mg/kg剂量37.5 mg/mL浓度的OA，第二组腹腔注射300 mg/kg剂量OA和22 mg/kg剂量的ALLO，第三组腹腔注射1%的CMC-Na作为对照，于给药1.5 h后脱颈处死动物，各组取肝脏0.1 g，放入已加1 mL tripure的5 mL EP管中。提取RNA，逆转录获得cDNA，以cDNA为模板，做两个平行样进行实时荧光定量检测，得到XDH/XOmRNA转录水平变化。

2 结果

2.1 RNA完整性及纯度

Wistar大鼠肝脏组织提取总RNA进行电泳，可观察到28S、18S、5S 三条带，见图1，说明所提取的总RNA无降解，可进一步用于后续实验。所提取的总RNA样品经Nanodrop-1000 超微量核酸测定仪测定波长260/280 nm的 吸光度A值,A260/A280值均介于1.8～2.0之间时，说明纯度较高。

图1 大鼠肝脏组织总RNA电泳图Fig.1 The electrophoresis of total RNA from the liver tissue of rates

2.2 目的基因电泳结果

Wistar大鼠肝脏组织XDH/XO基因RT-qPCR产物经1.5%的琼脂糖电泳，结果扩增出的目的条带，与所设计的片段大小一致，且条带较亮，表明扩增效率高，可用于后续实验,见图2。

图2 XDH/XO mRNA RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 The electrophoresis result of RT-PCR of XDH/XO mRNA from the liver tissue of rates

2.3 Wistar大鼠肝脏GAPDH及XDH/XO基因标准曲线及溶解峰

由溶解峰图可知大鼠GAPDH及XDH/XO基因纯度较高，由标准曲线ct值可得各稀释梯度cDNA的拷贝数，其中R2均接近1，说明以此标准曲线进行相对定量较准确，由于荧光强度均较强，故能保证荧光强度的增加与PCR的扩增相对同步，能准确检测PCR的表达，见图3、4。

2.4 OA致Wistar大鼠高尿酸血症动物模型XDH/XO 基因转录水平的变化

以GAPDH为内源控制物，得到XDH/XO基因转录水平的变化，Wistar大鼠腹腔注射300 mg/kg剂量的OA组，肝脏组织XDH/XO基因转录水平较对照组上调；同时注射300 mg/kg剂量OA和22 mg/kg剂量的ALLO组，肝脏组织XDH/XO基因转录水平较300 mg/kg剂量的OA组下调，见图5。实验结果表明本文所建立方法能灵敏地检测出Wistar大鼠高尿酸血症动物模型XDH/XO基因转录水平的变化。

图3 GAPDH基因标准曲线及溶解峰Fig. 3 The standard curves and melting curves of GAPDH gene

图4 XDH/XO基因标准曲线及溶解峰Fig.4 The standard curves and melting curves of XDH/XO gene

图5 OA致Wistar大鼠XDH/XO 基因转录水平的变化Fig.5 The change of stranscriptional-level of XDH/XO gene in Wistar rats after administration OA

3 讨论与结论

RT-qPCR法是在 PCR 反应中可以结合于双链 DNA 的小沟处并释放出荧光信号。随着反应的进行，靶基因的载量和荧光信号强度相对应，二者成一定的线性关系。所以通过收集荧光信号的强度，就可以间接来定量实验中的双链 DNA 的拷贝数[8-9]，具有操作简单，造价便宜等优点，且荧光信号与 PCR 产物有相应的线性关系，所以可以实现实时监控、定量检测目的基因的目的，目前广泛用于基因方面研究，但也存在非特异性信号的干扰，所以选择合适的样品建立标准曲线对于检测基因的表达尤为重要，当标准曲线的扩增效率在80%至120%之间，R2值接近1时，结果可信度较高，符合RT-qPCR要求[10]。本实验从健康Wistar大鼠新鲜肝脏组织中提取总RNA，经逆转录获得cDNA,梯度稀释后进行RT-qPCR扩增，建立Wistar大鼠GAPDH基因和XDH/XO基因的标准曲线，实验结果显示，GAPDH基因和XDH/XO基因扩增效率分别为92.2%和93.4%，在80%至120%之间；R2值分别为0.995和0.993，接近1；且溶解峰曲线单一无杂峰，可有效地排除非特异性型号的干扰，说明标准曲线可信度较高，符合RT-qPCR要求，表明我们成功地建立了RT-qPCR检测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的RT-qPCR检测方法。

自Johnson等成功地用OA诱导大鼠高尿酸血症模型以来，因其灵敏、简便、重复性好等特点成为了国内外高尿酸血症造模的主要方法[11-13]。所以本实验选用OA造模，诱导Wistar大鼠高尿酸血症模型。目前对OA诱导动物高尿酸血症模型的研究大多是代谢组学方面的研究[14-15],本实验利用所建立方法对OA致Wistar大鼠高尿酸血症动物模型XDH/XO基因转录水平的变化进行了研究，实验结果表明OA会影响XDH/XO基因的转录水平，模型组的转录水平升高，与预期相符，同时也验证了我们所建立的 RT-qPCR法测Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的方法是可行的，其可在转录水平上对高尿酸血症动物模型的XDH/XO基因进行分析。

本实验成功地建立了Wistar大鼠XDH/XO基因转录水平的RT-qPCR检测法，该方法特异性强，灵敏度高，具有很好的重复性，可用于XDH/XO基因的定性和定量检测，为高尿酸血症动物模型的研究和高尿酸血症发病机理以及新药开发提供了可靠的手段。

致谢

感谢中国医学科学院医学生物学研究所小动物实验部提供实验动物及动物实验饲养场地以及饲养动物。