深Ⅱ度烫伤后小型猪皮肤愈合的组织病理学研究*

邱 波 王 艳 郑晓霞 张海静 张 鑫 王凤乾 胡建廷

(1. 山东省药学科学院，山东省化学药物重点实验室，济南 2501010) (2. 山东英才学院，济南 250104)

烫伤是外科常见的创伤性疾病，大多数烫伤多为Ⅱ度以下的中、小面积烫伤[1]。为了更好地研究人类皮肤烫伤这一外科常见疾病，选择符合临床发病过程和创面主要因素的动物模型至关重要[2-4]。研究烫伤动物模型应选用与人体结构、功能、代谢及特征相似的动物。小型猪皮肤组织结构与人类很相似[5]，包括体表毛发的疏密、表皮厚薄、皮下脂肪层、表皮形态学和增生动力学(猪30 d，人21 d)，以及皮肤烧伤后的体液和代谢变化等均非常相似，是进行各种皮肤创伤动物模型制备的理想选择。文献报道的烫伤模型制备方法有电热烫伤和恒温恒压电烫伤，这些方法在运用当中各有其优缺点[6-8]。本研究参考上述烫伤方法的条件，使用恒温烫伤仪，将恒温烫伤仪探头于110 ℃下，持续接触20 s，压力约1 000 g，于巴马小型猪背部脊柱侧制备深Ⅱ度烫伤创面，每个烫伤创面面积约为20 cm2。分别在第1、3、7、14、21、28天观察皮肤创伤愈合情况，根据皮肤组织愈合的规律及实验的可操作性，选择在第1、

14、28天取样，利用HE、Masson染色及免疫组化CD31染色的方法观察皮肤在不同时间点修复的动态病理学变化。

1 材料与方法

1.1 动物来源与饲养环境

巴马小型猪普通级，12只，雌雄各半，4～6月龄，平均体质量14.6 kg，体长约65 cm，体高32 cm左右，胸围55 cm；由北京实创世纪小型猪养殖基地提供，生产许可证号：SCXK(京)2013 0008，实验动物质量合格证号：111014000000241，试验前适应性饲养1周以上。

饲养条件：巴马小型猪置不锈钢笼中于普通级环境饲养，每笼1只。室温19～26 ℃，湿度40%～70%，日温差≤4 ℃，换气次数8～10次/h，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。实验动物使用许可证号：SYXK(鲁)2014 0008。

1.2 试剂及仪器

苏木素-伊红(HE) 染色液由珠海贝索生物技术有限公司提供。 SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫组化试剂盒，规格：18 mL，批号：AG08164417，由北京博奥森生物技术有限公司提供。HT15-1KT Masson染色试剂盒，规格：50 mL，批号：20170710，由美国SIGMA-ALDRICH公司生产。

YLS-5Q台式超级温控烫伤仪，由济南益延科技发展有限公司生产。

1.3 方法

分别在烫伤后第1、3、7、14、21、28天观察皮肤创伤愈合的肉眼形态学变化并进行创面愈合率的测定。创面愈合率的测定方法为在巴马小型猪烫伤后第1、3、7、14、21、28天，分别对创面进行拍照，用ImageJ图像分析系统测算创面愈合残留面积(newarea at interval time，AI)与愈合面积百分率(healing rate，HR)，HR=(AO-AI)/AO×100%，AO(original incisional area)为烫伤后第1天创面面积[9]。选择在第1、14、28天的皮肤创面上分别切取约1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm的皮肤组织，经10%甲醛液固定进行常规脱水、包埋、石蜡切片、HE染色，并根据说明书步骤分别进行免疫组化CD31染色和Masson 染色[10]。

1.4 统计方法

采用 SPSS16.0软件对数据进行统计分析。定量指标采用均数±标准差描述。用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学检验；差异有统计学意义时(P≤0.05)，所有检验均为双侧检验 α=0.05。

2 结果

2.1 创面大体观察

烫伤制备后，创面呈现与烫伤探头形状相同的圆形，创面发白，无光泽，偶见轻微出血，烫伤创面与周围组织界限明显，略低于周围正常皮肤，质地较软，无渗出及分泌物。烫伤后第1天至7天，烫伤表面逐渐由白色转变为暗红色，无异味及分泌物，质地逐渐变硬，多数创面形成焦痂，触之皮革感。第7天至第14天，烫伤创面全部形成灰色焦痂，创面面积有收缩趋势，有少量创面焦痂部分脱落，脱落后的皮肤呈粉红色，触之柔软。烫伤第14天至28天，烫伤伤口逐渐脱痂，完成再上皮化，脱痂后皮肤多数呈暗红色，少数与正常皮肤颜色相同。创面处有毛发生长。图1 A-F分别为烫伤后第1、3、7、14、21、28天后的肉眼形态学观察。

图1 小型猪背部皮肤烫伤后不同时期的肉眼形态学观察Fig. 1 The gross morphology of skin wound healing of Minipig after deep second degree burn at different times

2.2 创面愈合率

对不同时间点的创面进行拍照，用ImageJ图像分析系统测算创面愈合残留面积(newarea at interval time，AI)与愈合面积百分率(healing rate，HR)，巴马小型猪背部皮肤烫伤后不同时期的愈合率见表1。由表1可见，雄性猪与雌性猪相比，雄性猪烫伤创面的愈合速率较快。

2.3 组织病理学

烫伤皮肤分别经HE、Masson、CD31染色方法进行组织病理学检查，图2A-C显示损伤已经累积到真皮深层，达到深Ⅱ度烫伤的标准。图2D-L显示烫伤后皮肤组织分别在第14天和第28天修复的组织病理学变化。具体组织病理学变化见图2。

表1 巴马小型猪背部皮肤烫伤后不同时期的愈合率Table 1 Healing rate at different periods after burn on the skin of Ba-Ma Minipig’s back

图2 巴马小型猪深Ⅱ度皮肤烫伤后的病理组织学观察注：A：烫伤第1天：创面表皮全层变性坏死脱落(三角形所示)，真皮深层呈凝固性坏死.(HE，×40);B：真皮层内胶原纤维肿胀变性呈均质 红染条索状(箭头所示).(Masson染色，×100);C：真皮深层显示未见标记的血管内皮细胞(三角形所示).(CD31染色，×100);D：图C 高倍镜下观察(三角形所示).(HE，×200);E：烫伤第14天：创面由新生表皮覆盖，表皮局灶性上皮岛增生(箭头所示)，还可见表皮上方 的结痂(三角形所示).(HE，×40);F：真皮深层内有少量淡染的胶原纤维(箭头所示).(Masson染色，×100);G：烫伤第14天：创面有少 量血管(箭头所示).(CD31染色，×100);H：图G的高倍镜下观察(箭头所示).(HE，×200); I：烫伤第28天：创面完全由新生表皮覆盖 (三角形所示)，真皮深层内含有较多的肉芽组织.(HE，×40); J：真皮深层内有多量淡染的胶原纤维(三角形所示).(Masson染色，×100); K：烫伤第28天，创面有大量血管(箭头所示).(CD31染色，×100); L：图K的高倍镜下观察(箭头所示).(HE，×200)Fig. 2 Histopathological observation on skin wound healing of minipig after deep second degree burnNote： A:On the first after burn,The epidermis show degeneration, necrosis and exfoliation (triangle), dermal manifeste as coagulative necrosis.(HE,×40); B:Collagen fibers in the layer of the dermis show swelling and degeneration, stained homogene ous red dyed cords(arrow). (Masson,×100); C:CD31 staining showed there is no blood vessel(triangle)(CD31 staining，×100); D:Higher magnification of FigureC (triangle). (HE,×200); E:On the 14th post burn, the wound covered with the newly grown epithelium, epithelial islands hyperplasia (arrow)and scab(triangle). (HE,×40); F:A small amount of lightly stained collagen fibers in the deep dermis (arrow). (Masson,×100); G: On the 14th, a little of blood vessel can be seen in the wound.(CD31,×100); H:Higher magnification of FigureG (arrow). (HE,×200); I:On the 28th, The wound is completely covered by the new epidermis(triangle), the more granulation tissue is present in the deeper layer of the dermis. (HE,×40); J:Lightly stained collagen fibers in the deep dermis (triangle).(Masson,×100); K: On the 28th, a great many blood vessel can be seen in the wound. (CD31,×100); L:Higher magnification of FigureK(arrow). (HE,×200)

3 讨论

皮肤创伤愈合包括各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成的复杂组合，表现出各种过程的协同作用。而不同层次和深度的皮肤烫伤引起的组织细胞变性坏死，会决定创面的修复方式，并直接影响皮肤的预后[11]。对于人的皮肤来说：如Ⅰ度烫伤因为基底细胞健在，无需特殊治疗，不影响预后，无疤痕；浅Ⅱ度烧伤累积表皮全层和部分真皮浅层乳头层，真皮层中的毛囊、汗腺和皮脂腺等附属器健在，2 周内可以自愈；而深Ⅱ度烧伤累积到真皮深层，真皮层中还有部分的毛囊、汗腺和皮脂腺等附属器健在，需要3～5周才能康复。

本试验通过对烫伤创面的组织学检查，证实损伤已经累积到真皮深层，建立了猪深Ⅱ度烫伤模型。随后观察深Ⅱ度烫伤的皮肤在不同时间点修复的病理学变化。肉眼形态学观察，烫伤后第1天至7天，烫伤表面逐渐由白色转变为暗红色，无异味及分泌物，质地逐渐变硬，多数创面形成焦痂，触之皮革感。第7天至第14天，烫伤创面全部形成灰色焦痂，创面面积有收缩趋势，有少量创面焦痂部分脱落，脱落后的皮肤呈粉红色，触之柔软。烫伤第14天至28天，烫伤伤口逐渐脱痂，完成再上皮化，脱痂后皮肤多数呈暗红色，少数与正常皮肤颜色相同。创面处有毛发生长。愈合率结果显示，雄性猪烫伤创面的愈合速率较快。组织病理学变化显示，烫伤后第1天，烫伤早期时创面表皮全层变性坏死脱落，真皮深层组织呈凝固性坏死，坏死组织内的胶原纤维经Masson染色染为橘红色，也未见标记的血管内皮细胞。烫伤后第14天，以肉芽组织增生为主。创面基本由新生表皮覆盖，表皮中局灶性上皮岛增生，皮肤附件修复良好。真皮深层中可见新生的肉芽组织及少量的胶原纤维生成，肉芽组织内血管数量相对较少。烫伤第28天，皮肤已经基本愈合。除表皮各层相对成熟外，真皮层内还含有肉芽组织及胶原纤维，肉芽组织内的血管数量及胶原纤维的含量均较烫伤后第14天增多，但该时期内皮肤组织还未完全成熟，此期内肉芽组织还是在向瘢痕组织进行转变，这一转变过程可能还需要一段时间来完成皮肤组织的完全修复。