大鼠BMSCs与ADSCs全基因组DNA甲基化差异分析

陈旭涛 万卓 韦梦影 杨国栋 宋应亮

骨髓间充质干细胞(BMSCs)在间充质干细胞中最早被发现，并长期应用于组织工程和干细胞研究领域中[1-2]。2001 年Zuk等[3]在脂肪组织中分离提取出了脂肪间充质干细胞(ADSCs)，随后大量研究证实了其与BMSCs有着相似的多向分化潜能[4-5]。而ADSCs相对BMSCs取材容易、创伤小、易扩增的优点也引起了各方广泛关注，逐渐成为时下研究热点。BMSCs与ADSCs是众多间充质干细胞中来源最丰富的，且被广泛应用于目前相关实验研究与临床运用中。但随着对这2 种不同组织起源的间充质干细胞的深入研究，大量实验发现，BMSCs具有更高的成骨和成软骨倾向[6-7]，而ADSCs则具有更高的成脂、成血管倾向[8-9]。后期Dmitrieva等[10]还发现，相较于BMSCs，ADSCs有着更强的增殖潜能。此外，ADSCs与BMSCs不仅在分化表型以及增殖能力上存在差异，二者之间在免疫表型上也存在着相似但不同的地方[11]。BMSCs与ADSCs均属于间充质干细胞，在组织工程，再生与修复医学等领域起到重要作用，但其功能及表型差异机制尚未阐明。

近年来，随着对表观遗传学的研究日益深入，研究者发现表观遗传修饰不仅参与了细胞的生长、分化、增殖等重要细胞生物学过程，而且在生物的适应性和变异性中也起着重要的调控作用[12]。常见的表观遗传学修饰有DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰等，其中DNA 甲基化是目前研究最广泛最透彻的表观遗传学机制之一，其通过甲基转移酶将来源自S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，随后通过DNA的复制向下遗传[13]。DNA甲基化能引起DNA与染色质结构的改变，影响其与蛋白质相互作用方式，进而导致基因的表达改变[12]。本研究利用 DNA 甲基化测序技术分析BMSCs与ADSCs 基因组甲基化分布差异情况，为进一步分析BMSCs与ADSCs分化和免疫表型差异提供分子依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

α-MEM(Gibco，美国)；胎牛血清，青链霉素双抗(HyClone，美国)；成骨、成脂诱导分化培养基(苏州赛业)；胶原酶I、油红O、茜素红S染色液(Sigma，美国)；小鼠抗大鼠单克隆抗体CD29、CD90、CD34、CD45(BD Pharmingen，美国)；基因组DNA提取试剂盒(北京天根)；CO2培养箱(Shellab，美国)；流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；SD大鼠(8 周，SPF级)，由空军军医大学实验动物中心提供。

1.2 ADSCs与BMSCs的原代培养

ADSCs提取方法：SD大鼠脱颈处死后在超净台中取皮下脂肪于培养皿中，将脂肪组织剪碎至糜状后转移至离心管中，加入等体积0.1%胶原酶Ⅰ，将离心管置于37 ℃摇床(200 r/min)中消化50 min。取等体积α-MEM终止消化后，用200目钢筛过滤，收集过滤后的液体于离心管中离心5 min(1 000 r/min)。培养基重悬细胞沉淀并均匀铺于培养皿中，置于37 ℃， 5% CO2孵箱中培养。

BMSCs提取方法： SD大鼠脱颈处死后于超净台中取大鼠股骨、胫骨于培养皿中，用注射器将骨髓冲出至骨膜发白，收集骨髓于无菌离心管中。加入2～3 ml红细胞裂解液裂解5 min。收集裂解产物于离心管中离心5 min(1 000 r/min)。培养基重悬细胞沉淀并均匀铺于培养皿中，置于37 ℃， 5% CO2孵箱中培养。

1.3 ADSCs与BMSCs的表面抗原检测

利用胰酶将ADSCs与BMSCs两组细胞分别消化后，调整细胞密度为1×106/ml。PBS离心洗涤1 次后弃上清，100 μl PBS重悬，分别加入FITC标记的IgG、CD29、CD90、CD34、CD45抗体冰上避光孵育15 min后， PBS洗涤3 次，流式细胞仪进行检测。

1.4 ADSCs与BMSCs的成脂、成骨诱导

将第2 代ADSCs与BMSCs消化后分别制成细胞悬液，并以2×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞扩增至80%左右时，分别加入成脂、成骨诱导液培养基进行诱导。成脂诱导14 d， 换液1 次/3 d，诱导结束后，4%多聚甲醛固定20 min，油红O染色并拍照。成骨诱导21 d， 换液1 次/3 d，诱导结束后， 4%多聚甲醛固定20 min，行茜素红染色并拍照。

1.5 DNA提取与样品检验

胰酶消化ADSCs和BMSCs，PBS吹打洗涤2 次，10 000 r/min离心后，弃上清，加入200 μl缓冲液GA， 4 μl RnaseA震荡混匀静置5 min，随后加入 20 μl Proteinase K溶液，混匀。余下具体步骤参照TIANamp Genomic DNA Kit说明书。取50 ng DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，如电泳结果为规则单一条带则为合格样品。准备DNA样品：总量≥3 μg，浓度≥50 ng/ul；A260/280在1.8～2.0之间、A260/230>1.4、无降解，无蛋白及RNA污染，送公司分析(成都生命基线科技有限公司)。

1.6 文库构建及分析

①利用超声将基因组DNA打断为300 bp的小片段; ②用修复缓冲液进行DNA末端片段修复、A尾缓冲液进行3' 端加A碱基，连接测序接头; ③采用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold kit对DNA样本进行Bisulfite处理; ④脱盐处理后切胶回收，并选择合适大小的文库片段，进行PCR扩增处理后再次进行文库片段大小选择; ⑤选择合格的文库用于上机测序(华大基因科技有限公司); ⑥将测序结果与参考基因组后进行信息分析及个性化分析。

1.7 统计分析

通过卡方检验确定样品间是否存在差异来进行DMR筛选，进一步采用GoMiner 数据库行基因本体(gene ontology，GO)分析和Pathway分析。

2 结 果

2.1 ADSCs与BMSCs的细胞鉴定

将正常大鼠骨髓与脂肪来源的间充质干细胞分离培养，采用流式细胞仪检测ADSCs与BMSCs的纯度(图1)，细胞中CD29、CD90表达为阳性，CD34、CD45为阴性。然后通过成脂和成骨诱导方法来评价ADSCs与BMSCs的分化潜能(图2)，成脂诱导培养14 d后以及成骨诱导培养21 d后，对2 组不同来源的细胞进行油红O以及茜素红染色后发现， 2 组细胞均具有多向分化潜能。

2.2 ADSCs与BMSCs全基因组甲基化数量及水平分析

ADSCs全基因组水平中CG，CHG以及CHH甲基化位点的数量均多于BMSCs(表1)；从不同区域以及功能元件C甲基化水平比较而言，ADSCs与BMSCs基因组在启动子区均呈现低甲基化状态，但ADSCs基因组在启动子区以及5'UTR端CG甲基化水平高于BMSCs(图3， 表2)。

图1 ADSCs与BMSCs的干细胞标志物流式细胞仪检测结果(%)

图2 ADMSCs和BMSCs成脂成骨分化 (×100)

Fig 2 Adipogenic differentiation and osteogenic differentiation of ADSCs and BMSCs (×100)

2.3 差异性甲基化区域(DMR)分析

差异甲基化区域(differentially methylated regions，DMR)指在不同样本中基因组表现出不同的甲基化状态的DNA片段。其中，CG甲基化水平不同的DMR分析结果如表3所示，BMSCs与ADSCs基因组间在常染色体与性染色体基因组上存在大量DMR。

表1 ADSCs与BMSCs不同分布类型甲基化C的数量及比例

Tab 1 The number and proportion of different distribution types of methylation C of ADSCs and BMSCs

mCGmCHGmCHHADSCsmC number31826778253825774791proportion (%)96.8690.7732.358BMSCsmC number27628406180490520786proportion (%)97.5250.6371.838

2.4 DMR关联基因分析

对所有染色体上DMR相关基因进行GO(gene ontology)和Pathway分析，共富集到4 603 条GO条目，其中610 条GO条目具有显著差异(P<0.05)(图4)。通过Pathway分析可以得到322 条通路，其中有98条通路显著富集(P<0.05)(图5， 表4)。其中，癌症相关通路，MAPK信号通路，Ras信号通路及相关基因等在BMSCs与ADSCs基因组中甲基化水平差异显著。

图3 ADSCs与BMSCs全基因组不同功能元件区域的甲基化平均水平分布

Fig 3 The distribution of methylation level in different functional elements in ADSCs and BMSCs genome

3 讨 论

DNA甲基化可以发生在启动子、增强子、转座子、沉默子等不同基因区域和功能元件上。本实验通过对大鼠BMSCs与ADSCs的全基因组进行测序，发现BMSCs与ADSCs在全基因组甲基化上存在差异且这种差异分布于各条染色体中，同时ADSCs全基因组甲基化位点数量显著高于BMSCs。进一步对CG甲基化水平不同的DMR进行分析，发现BMSCs与ADSCs基因组间在常染色体与性染色体基因组上存在大量CG甲基化水平不同的DMR，而这些DMR可能是导致BMSCs和ADSCs功能与表型差异的重要因素之一。有趣的是，本研究观察到在2 种细胞中基因启动子区虽均呈低甲基化状态，但ADSCs启动子区甲基化水平高于甲基化，这可能是探究BMSCs与ADSCs功能差异的重要靶点之一。本研究一共检测到10 万多个甲基化差异位点，其中通过GO分析和Pathway分析，富集到4 000多个GO条目和300 多个通路，这些通路和基因对本研究BMSCs与ADSCs的差异具有重要的指导意义。

表2 ADSCs与BMSCs不同基因区域和功能元件上各类型C的甲基化水平

表观遗传学在胚胎发育、基因表达、细胞生长及机体免疫调节等重要生命过程中均发挥重要作用。尽管MSCs在同种异体应用(或使用HLA匹配的供体细胞)中具有很好临床前景，但是在一些治疗中仍然需要自体移植方法，例如长期植入MSCs衍生的工程化组织，这使得无法获得足够数量的所需细胞类型成为MSCs治疗的重大挑战。下一步通过功能及表观编辑，阐明决定功能差异的关键甲基化基因，可以在此基础上通过改变这些差异基因的甲基化状态来改造这2 种细胞，使其更易向我们需要的方向分化发展，这对组织工程及再生医学有着非常重要的意义。此外，越来越多的证据表明，表观遗传标记之间存在着相互作用，如DNA甲基化和组蛋白乙酰化之间协同参与了基因转录和异常基因沉默的过程[14-18]。一些研究表明，在基因沉默过程中，DNA甲基化的水平和模式指导组蛋白修饰，但另一些研究则认为，DNA甲基化的状况受到组蛋白修饰状态的影响。到目前为止，人们对基因激活的各种机制已经有了较为深入的了解，但在研究基因沉默时，表观遗传标记之间的相互作用机制以及级联顺序方面仍存在着许多的未知。即使还需要更多关于以上问题的探索，但不同类型的表观遗传标记之间的密切相关性是一定的，且常常以自我强化的方式在调节不同的生命活动中发挥着重要作用。因此，通过BMSCs和ADSCs全基因组DNA甲基化的差异分析，提示我们BMSCs和ADSCs在其它表观遗传标记上可能同样存在差异，并与DNA甲基化协同发挥作用影响BMSCs和ADSCs在分化和免疫表型上的差异。

表3 ADSCs与BMSCs基因组DMR数目及长度统计

图4 ADSCs与BMSCs的DMR GO分析结果 图5 ADSCs与BMSCs的DMR相关基因的Pathway功能显著性富集分析(前20)

Fig 4 The results of DMR GO analysis of ADSCs and BMSCs Fig 5 The functional enrichment analysis of the pathway of DMR-related genes of ADSCs and BMSCs (top 20)

表4 DMR相关Pathway中的差异基因数目(前10)

Tab 4 The number of differential genes in DMR-related pathways(top10)

本研究中发现的基因甲基化位点、甲基化水平与相应基因的表达情况仍需进一步验证。深入探讨它们之间的关系，及其与细胞功能表型差异的关系有望为表观编辑ADSCs和BMSCs，增强其定向分化的潜能提供新的思路。