人胎盘粉外敷对糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的影响

赵富生，武庚★，张晓莉，张际绯，石学魁，刘志新，李玉婷，赵晓翔，戴安

（1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157000；2.西双版纳州人民医院，云南 西双版纳 666100）

0 引言

糖尿病已成为严重威胁人类健康和生活质量的常见疾病。据统计，2015 年全球约有4.15 亿人罹患糖尿病，预计到2040 年全世界糖尿病患者人数将达到6.42 亿[1]。统计资料显示，我国成年人糖尿病患病率高达11.6%，如据此推算，我国糖尿病患者人数达1.1 亿，成为世界上糖尿病患者人数最多的国家[2,3]。糖尿病足是一种常见的糖尿病并发症，由血糖代谢紊乱而引起的局部神经异常和下肢肢端血管病变，临床表现为足部局部组织感染和溃疡，是导致患者致残和死亡的重要原因之一[4]。研究资料显示，在我国糖尿病足约占门诊糖尿病患者的2%，占住院糖尿病患者的12.4%[5]。目前，尽管中西医综合治疗可缓解糖尿病足症状，但远期疗效并不明显。人胎盘又称紫河车，据《本草纲目》记载“紫河车味苦、咸、性温”，具有“安神、补气、益精、解毒、补气之功效”。现代医学研究表明，胎盘提取物具有防止粘连、减轻疼痛和促进上皮愈合的作用[6]。本研究通过观察胎盘粉外敷对糖尿病大鼠皮肤溃疡愈合的影响，旨在寻找治疗糖尿病皮肤溃疡的有效方法。

1 材料

1.1 动物

SPF 级1 月龄SD 大鼠30 只，雌雄不限，体质量90～120 g，自由食水，室温(20±2)℃条件下普通饲料分笼喂养，昼夜12 h 交替光照。实验动物由哈尔滨医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（黑）2012-010，实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.2 药物、试剂和仪器

紫河车胶囊（北京同仁堂健康药业股份有限公司）；ICAM-1 兔抗大鼠单克隆抗体（Abcam 公司）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；ELISA 试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；体式显微镜（SMZ745 型，Nikon公司）；酶标仪（2013A70D，Thermo Fisher 公司）；高压蒸汽消毒锅（GYZ-2000 型，上海博讯实业公司）；电子分析天平（A2104 型，上海方瑞仪器厂）。

2 方法

2.1 建模及实验分组

建模前大鼠禁食12h，腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60mg/kg）诱发糖尿病，注射3d 后，尾静脉采血检测随机血糖水平，并观察大鼠体重变化。大鼠空腹血糖＞16.7mmol/L 时，认为糖尿病模型制备成功[7]。本研究中20 只大鼠制备糖尿病模型，采用随机数字表法将大鼠随机分为模型组（B 组）和治疗组（C 组），每组10 只大鼠。选取10 只正常大鼠为对照组（A 组）。

2.2 皮肤溃疡制备及干预

用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉各组大鼠，常规消毒后，在大鼠脊柱腰背部两侧标记直径为2.0cm 的圆形图案，用手术剪沿着标记线剪去全层皮肤和皮下组织，止血后用无菌纱布包扎，次日起每日用50% 冰醋酸涂抹创面，制备皮肤缺损溃疡模型。溃疡形成后，A 组和B 组用生理盐水清洗后包扎处理，每日1 次；C 组用生理盐水清洗溃疡后外敷胎盘粉包扎，每日处理1 次。

2.3 溃疡创面愈合评价

溃疡制备第0、2、4、6、8、10、12、14d 测量各组大鼠皮肤溃疡面积。具体方法如下：将透明薄膜覆盖在溃疡表面，用记号笔将溃疡轮廓勾画在透明薄膜上，取下透明薄膜，测量最长和最短直径后求平均值，计算溃疡面积。

2.4 炎性细胞因子含量检测

溃疡制备第14d，乙醚麻醉后处死各组大鼠，切取溃疡与正常皮肤交界处组织匀浆取上清液，根据ELISA 试剂盒的操作说明，测定各组大鼠溃疡组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18的含量。

2.5 细胞间黏附分子-1 蛋白表达检测

溃疡制备第14d，麻醉处死各组大鼠，切取溃疡与正常皮肤交界处组织，加入裂解液研磨，4℃、12000r/min 离心，取上清液，采用BCA 法测定蛋白含量。取适量上清液于沸水中煮5min 变性，经凝胶电泳后转移至PVDF 膜上，置于5%脱脂奶粉溶液封闭2h，滴加TBST 稀释的兔抗大鼠细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）一抗，4℃孵育过夜，次日TBST 漂洗PVDF膜3 次，滴加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗，室温孵育2h，TBST 漂洗膜3 次，使用化学增强发光剂（ECL）显影，凝胶成像，采用Quantity One 软件分析目标蛋白条带的灰度值。

2.6 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计软件对实验数据进行统计学分析，数据均以mean±SD 表示。多组间比较采用单因素方差分析。两组之间比较使用最小显著性差异检验（LSD）。P＜0.05 认为具有统计学差异。

3 结果

3.1 大鼠皮肤溃疡面积比较

腹腔注射STZ 后，模型组和治疗组中大鼠进食和饮水量明显增多，体重逐渐减轻，体质瘦弱，毛发呈黄色且无光泽。如图1 所示，溃疡制备第0 天，各组大鼠脊柱两侧创口规整，有少量渗出。溃疡制备第14 天，对照组溃疡缩小，可见新鲜肉芽组织，有鼠毛生长；模型组溃疡愈合差，溃疡边缘可见瘢痕组织，几乎看不到新鲜肉芽组织，有脓性渗出；治疗组溃疡缩小，溃疡周边可见少量肉芽组织及渗出物。不同时间点各组溃疡面积比较如表1 所示，与对照组相比较，模型组和治疗组中大鼠皮肤溃疡面积较大（P＜0.05）；与模型组相比较，治疗组中大鼠皮肤溃疡面积明显缩小（P＜0.05），但仍大于对照组（P＜0.05）。

图1 各组大鼠皮肤溃疡愈合情况

表1 不同时间点各组大鼠皮肤溃疡面积比较

3.2 炎性细胞因子含量比较

各组炎性细胞因子含量如图2 所示，与对照组相比较，模型组和治疗组溃疡组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18 含量均明显增高（P＜0.05）；与模型组相比较，治疗组溃疡组织炎性细胞因子均显著减低P＜0.05），但仍高于对照组（P＜0.05）。这些结果提示，胎盘粉外敷能够降低溃疡组织炎性细胞因子的含量，减轻溃疡组织炎症反应。

图2 各组溃疡组织炎性细胞因子含量比较

3.3 细胞间黏附分子-1 蛋白表达

各组溃疡组织中ICAM-1 蛋白表达如图3 所示，与对照组相比较，模型组和治疗组ICAM-1 蛋白表达均明显降低（P＜0.05）；与模型组相比较，治疗组ICAM-1 蛋白水平明显增高（P＜0.05），但仍低于对照组（P＜0.05）。这些结果提示，胎盘粉外敷能够促进溃疡组织中ICAM-1 蛋白合成，促进溃疡组织创面愈合。

图3 各组溃疡组织中ICAM-1 蛋白表达水平比较

4 讨论

糖尿病皮肤溃疡是由于糖代谢紊乱、神经病变、血液循环障碍以及感染等多种因素共同作用诱发的一种糖尿病并发症。在临床中，糖尿病皮肤溃疡治疗多根据原因进行针对性地治疗,如清创换药、红外线短波局部照射治疗等，但疗效欠佳。在重度溃疡治疗过程中，因反复清创、换药等操作,给患者带来极大的痛苦，也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此，寻找一种有效的治疗方法是目前临床急需解决的重大问题。近年来，越来越多的研究表明，中医药对糖尿病皮肤溃疡具有显著疗效。

现代医学研究认为，胎盘提取物具有防止粘连、减轻疼痛和促进上皮愈合的作用[8-9]。此外，有研究表明，人胎盘组织中含有蛋白质、糖、钙、维生素、免疫因子、促性腺激素等多种生物活性物质，具有抗感染、抑制尿激酶激活和免疫调节功效，能够有效促进创伤愈合[10-11]。Kwon 等[12]研究发现，人胎盘提取物能够调节成纤维细胞增殖、分化促进创口愈合。糖尿病皮肤溃疡常常继发于老年患者，病程长，创口愈合慢，反复发作，且多伴有营养不良等原发性疾病，临床治疗往往依赖于外科手术治疗，极大地增加了手术风险。

本研究中，以糖尿病大鼠为研究对象制备慢性溃疡模型，观察胎盘粉外敷对溃疡愈合的促进作用。研究发现，采用人胎盘粉外敷不仅能够促进大鼠糖尿病皮肤溃疡创面愈合，同时也可降低溃疡组织中炎症细胞因子的含量。IL-1β、IL-6、和IL-18 是白细胞介素家族成员，能够促进多种炎症细胞活化和浸润，并介导炎症的级联放大效应。TNF-α 来源于单核巨噬细胞，具有促炎症和导致组织炎性损伤的作用[13]。人胎盘粉中含有多种生物活性物质，具有抑制炎症反应，加速创伤愈合的功能。因此，我们推测，胎盘粉外敷促进溃疡愈合可能与这些生物活性物质的抗炎作用相关。

ICAM-1 属于细胞表面糖蛋白家族成员，具有维持组织形态结构，调节内皮细胞间紧密连接以及加强细胞与基底膜之间黏附的作用，并参与白细胞和内皮细胞迁移过程。在机体免疫、细胞间信号转导、细胞生长及分化、炎症反应、毛细血管形成等过程中发挥重要的作用。研究表明，ICAM-1 通过与血管内皮细胞表面的特异性受体结合而发挥特定的生物学作用，如炎症时ICAM-1 表达升高介导白细胞的活化，为白细胞跨越内皮游出提供了条件[14]。本研究中，人胎盘粉外敷能够促进大鼠糖尿病皮肤溃疡创面愈合，我们推测可能与胎盘粉促进溃疡局部组织中ICAM-1 表达有关，但机制尚不清楚。

总之，应用人胎盘粉外敷能够促进糖尿病溃疡疮面愈合，为糖尿病皮肤溃疡治疗提供了一种有效的方案，但具体治疗机理还需要进一步深入研究。