Panx1在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

张晖力，牟妍希，田雨，杨立群，王林

根据2018年全球癌症统计数据，肺癌患者占确诊的癌症患者总数的11.6%，同时肺癌的死亡人数占癌症总死亡人数的18.4%，肺癌以高发病率和高死亡率居于首位，其中非小细胞肺癌（NSCLC）患者约占所有肺癌患者人数的80%［1］。迄今为止，手术仍然是NSCLC最有效的治疗选择，但仍然有一部分NSCLC 患者诊断时已经进入晚期疾病阶段，错过最佳的手术时机，导致预后不佳。因此，寻找NSCLC发生发展中重要的分子靶点可以为NSCLC 的诊断及预后评估提供新的思路。2000年，Panchin等［2］研究发现了缝隙连接通道蛋白家族的3 个新成员，包括Panx1、Panx2 和Panx3。近年来的研究表明，Panx1 与多种肿瘤的分化、转移存在相关性［3］。然而，Panx1 在NSCLC 方面的研究还鲜有报道。本研究运用Real-time PCR、免疫组化等技术检测NSCLC组织及癌旁组织中Panx1 的表达情况，并进一步分析其在NSCLC方面的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年11月—2017年12月大连大学附属新华医院收治的30例肺癌患者的组织标本，病理诊断均为NSCLC，保留癌组织及配对的癌旁组织，其中的25例组织标本进行了实时荧光定量PCR和免疫组化实验，另5例组织标本只进行了免疫组化实验。患者中男15例，女15例，年龄39～77岁，平均（58.43±10.71）岁。病理分级按照WHO病理分级标准：高分化13例，中分化11例，低分化6例。临床分期采用国际抗癌联盟第7版肺癌TNM分期标准，其中：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例。选取大连大学附属新华医院病理科保存的10例正常肺组织蜡块作为免疫组化实验的对照组。所有标本入组标准：患者病历资料完整，术前均无放化疗。所有研究对象对本次研究知情并签署知情同意书。Panx1兔抗人一抗及山羊抗兔IgG 二抗选购自Bioworld 公司，免疫组化MaxVisionTM试剂盒、DAB 染色试剂盒购自迈新公司，RNA 提取试剂盒（No.9108）、去除基因组DNA 的反转录试剂盒（No.RR047A）、SYBR荧光染料（No.RR066A）购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。实时荧光定量PCR 仪购自博日科技公司（型号：FQD-96A），核酸及蛋白分析仪选自Biochrom 公司（型号Biowave DNA），PCR核酸扩增仪购自基因有限公司（型号：2720型）。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR （1）引物序列。目的基因Panx1 上游5′- CCTGACAAACCTTGGCATGA-3′，下游5′ -CAGAAGTCTCTGTCGGGCATT-3′，扩增产物169 bp；内参基因β-actin 上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，扩增产物186 bp。（2）RNA 提取。采用RNA 提取试剂盒提取RNA，提取的总RNA 经凝胶电泳检测完整性，并用核酸蛋白分析仪检测RNA 纯度及浓度，A280/A260≥1.8 为合格，可用于逆转录；cDNA合成：取1 µg RNA 进行逆转录反应；荧光定量PCR 反应条件：预变性95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环。每个样本设置3 个检测复孔。以2-ΔCt值代表样本中Panx1 mRNA的相对表达水平。

1.2.2 免疫组化 将收集到的蜡块组织按3µm 厚度切片，贴片、烘烤后采用MaxVision 法进行免疫组化。切片经脱蜡脱水干燥，柠檬酸盐煮沸行抗原修复，自然冷却后PBS冲洗3次，每次2 min，滴加3%H2O2处理10 min 灭活内源性酶，PBS冲洗3次，每次2 min，滴加Panx1兔抗人一抗（1∶100）孵育60 min，PBS 冲洗3 次，每次2 min，滴加山羊抗兔IgG 二抗孵育10 min，之后用PBS 冲洗3 次，每次2 min，DAB 染色、苏木素复染、盐酸乙醇分化、氨水返蓝、梯度乙醇脱水透明后封片，于显微镜下观察。

由2位病理科医师双盲阅片。染色强度评分：无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。阳性细胞百分比评分：≤5%计0 分，5%～25%计1 分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分；总分为染色强度评分与阳性细胞百分比评分的乘积［4］，总分＜4分为阴性，总分≥4分为阳性。

1.3 统计学方法 用SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差（）表示，癌组织及癌旁组织间比较采用配对样本t检验。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Panx1 mRNA在NSCLC组织及配对癌旁组织中的表达 25例NSCLC组织中Panx1的相对表达量为25.31±3.55，与其配对的癌旁组织中Panx1的相对表达量为12.42±2.29，癌组织中Panx1 mRNA的表达水平高于与其配对的癌旁组织，差异有统计学意义（t=4.030，P＜0.01）。

2.2 Panx1蛋白在NSCLC 组织、癌旁组织及正常肺组织中的表达 Panx1蛋白主要在胞质中表达，阳性颗粒呈棕黄色或棕褐色分布，见图1。癌组织、癌旁组织、正常肺组织中Panx1 蛋白的阳性表达率分别为50%（15/30）、13.3%（4/30）、0，癌组织中的Panx1蛋白的阳性表达率均高于配对癌旁组织及正常肺组织，差异均有统计学意义（χ2分别为9.320、6.009，均P＜0.017）。

2.3 Panx1蛋白的表达与临床病理特征的关系 不同年龄、性别、胸膜侵袭情况、病理分级分组肺癌患者组织中Panx1蛋白的阳性表达率比较差异无统计学意义。临床分期Ⅲ～Ⅳ期组的Panx1 蛋白阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期组，有淋巴结转移组的Panx1蛋白阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Relationship between Panx1 expression and clinicopathological parameters of NSCLC patients表1 Panx1蛋白表达与NSCLC临床病理特征的关系例（%）

3 讨论

Panx1 是细胞膜上的六聚体半通道，细胞外K+浓度的升高、对细胞膜的机械拉伸刺激、膜电压的变化、S-亚硝基化、一氧化氮（NO）、细胞外pH的变化、与嘌呤能和腺苷受体的相互作用或caspase3的切割都可以导致Panx1半通道的开放［5］。Panx1半通道的开放在肿瘤细胞凋亡过程中起重要作用，细胞膜上Panx1半通道在肿瘤细胞凋亡过程中被激活开放，导致三磷酸腺苷（ATP）由细胞内释放到细胞外，进而使胞外ATP 浓度升高，而肿瘤微环境中的高水平ATP作为一种信号，可引起巨噬细胞、细胞毒性T细胞的募集，从而促进肿瘤抗原呈递和抗肿瘤免疫［6-7］。同时，胞外ATP 浓度的升高还可进一步使Panx1 通道开放，进而形成正反馈，扩大Panx1 在细胞凋亡中的作用［8］。

Furlow 等［9］研究证实Panx1 通道的小分子抑制剂可降低乳腺癌转移的效率。Penuela 等［10］研究发现Panx1 在黑素瘤进展过程中上调，可促进肿瘤生长和转移。Wei 等［11］研究发现用Panx1 siRNA 转染后，U87-MG 恶性神经胶质瘤细胞系的增殖减少。Swayne等［12］研究发现敲除Panx1可以促进神经母细胞瘤的分化，从而降低神经母细胞瘤的恶性表型。这些研究证实在某些肿瘤细胞中Panx1 的表达上调，并且可以增加某些肿瘤细胞的转移能力。因此，选择性抑制Panx1的表达和功能可能为某些癌症的治疗带来新的思路。

Derangere 等［13］研究发现肝X 受体β 与Panx1 相互作用后，可以特异性诱导caspase-1依赖性结肠癌细胞死亡。Xie 等［14］研究发现Panx1 是潜在的肿瘤抑制因子，在肝癌细胞组织中以甲基化的形式存在。Wu 等［15］研究发现上调Panx1 的表达可以降低睾丸癌细胞株I-10/DDP的耐药性，从而增强顺铂对耐药型睾丸癌细胞的毒性作用。Xiang 等［16］证实Panx1通过独立于其规范通道功能的过程在体外和体内减轻横纹肌肉瘤的恶性特性。刘传亮等［17］研究显示Panx1在肝癌组织中的表达量明显低于癌旁组织，并且Panx1的过表达能够明显抑制体内外肝癌细胞增殖能力。这些研究证实Panx1在不同的肿瘤细胞中的作用存在差异，提示可以针对不同的肿瘤细胞采用不同的Panx1 干预，这可能为临床上不同肿瘤的靶向治疗提供新的靶点和依据。

Fig.1 Immunohistochemical detection of Panx1 expressions in different tissues(×200)图1 免疫组化检测不同组织Panx1的表达（×200）

本研究中，PCR 结果和免疫组化结果均显示NSCLC组织中Panx1的相对表达水平显著高于与其配对癌旁组织。这提示Panx1在NSCLC的发生中起到一定的作用，然而Panx1 在NSCLC 中起促进作用或是代偿性抑制作用仍待进一步探究。本研究结果显示，临床TNM分期Ⅲ～Ⅳ期组的Panx1蛋白阳性表达率显著高于Ⅰ～Ⅱ期组，提示Panx1在NSCLC的进展中起到重要作用，高水平的Panx1 表达可能预示NSCLC进展到了晚期阶段。此外在有淋巴结转移的患者的NSCLC 组织中，Panx1 蛋白的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，提示Panx1 可能参与NSCLC 的远处转移及侵袭过程，有助于为临床上淋巴结转移的风险评估提供依据。

综上所述，Panx1 可能在NSCLC 的发生发展及转移侵袭中起重要作用，为临床上NSCLC的早期诊断及预后情况评估提供新的思路。然而Panx1 在NSCLC 发生发展及转移中的具体作用仍未明确，今后将从细胞层面揭示Panx1在NSCLC的发生发展及转移侵袭中的具体作用，进而为NSCLC的治疗提供新的思路。