犬腺病毒(Ⅱ型)阳性血清的研制及应用

赵炜，孙淼，薛青红，陈延飞，韩爽，印春生

(中国兽医药品监察所，北京 10081)

犬腺病毒(canine adenovirus，CAV)属于腺病毒科哺乳动物病毒属，犬腺病毒是哺乳动物中致病性最强的病毒之一，分为两型，Ⅰ型犬腺病毒引起犬传染性肝炎和狐狸脑炎，Ⅱ型犬腺病毒引起犬传染性喉气管炎和肠炎[1]。在我国犬腺病毒病感染十分普遍，犬不分品种、年龄和性别均可发生，犬科其它动物感染也十分广泛，如狐狸、狼等。

近几年我国新研制并批准了多个不同毒株生产的犬腺病毒相关兽用弱毒活疫苗，如犬五联活疫苗、狐狸脑炎活疫苗等。上述含犬腺病毒组分的兽用弱毒活疫苗产品的质量检验(外源病毒检验、鉴别检验、效力检验等)均需使用犬腺病毒阳性血清[2-3]。但是，目前我国尚无标准化、商品化的犬腺病毒阳性血清供应，评价机构和生产企业均使用非标定、非标准、非商品化的犬腺病毒阳性血清进行质量检验，给疫苗的质量安全带来了极大隐患。开展标准化的犬腺病毒阳性血清研究非常重要。

中国兽医药品监察所以自身鉴定和保存的犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)的MDCK细胞适应毒为材料，对免疫动物、免疫佐剂和免疫程序进行深入优化和创新，成功研制犬腺病毒(Ⅱ型)阳性血清，并对其实际应用场景进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 犬腺病毒Ⅱ型弱毒(2RZ株)由山东齐鲁动物保健品有限公司提供，犬腺病毒Ⅱ型弱毒(XN3株)由杨凌绿方生物工程有限公司提供，犬腺病毒I型病毒、犬腺病毒Ⅱ型病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、狂犬病病毒，牛病毒性腹泻/黏膜病病毒，均由中国兽医药品监察所鉴定、保存。

1.1.2 实验动物 未免疫过任何腺病毒相关疫苗的6月龄健康易感山羊，购自北京门头沟某养殖场。

1.1.3 血清 狂犬病病毒阳性血清、犬瘟热病毒阳性血清、犬副流感病毒阳性血清、犬细小病毒阳性血清，均由中国兽医药品监察所鉴定、保存。

1.1.4 细胞和培养基 猫肾细胞(CRFK)、犬肾细胞(MDCK)、Vero细胞、MDBK细胞均由中国兽医药品监察所提供，MEM细胞营养液和胎牛血清购自美国Hyclone生物化学制品(北京)有限公司。

1.1.5 疫苗 狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)，由山东齐鲁动物保健品有限公司生产，犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒病、细小病毒病五联活疫苗由杨凌绿方生物工程有限公司生产，狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)由吉林特研生物技术有限责任公司生产。

1.1.6 其他 15 mL 30 KD超滤浓缩管购自Millipore公司，PEG6000购自Merck公司， MontanideTMGel 01 ST佐剂购自法国Seppic公司，兔抗羊IgG H&L(FITC)二抗购自abcom公司。

1.2 方法

1.2.1 试验动物的筛选 经颈静脉采集山羊血清，选择犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病病毒抗体均为阴性且无牛病毒性腹泻/黏膜病病毒污染的6月龄健康山羊用于血清制备。

1.2.2 病毒液的制备

1.2.2.1 基础病毒液的制备 取犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)的细胞适应毒接种已长成单层的MDCK细胞，37 ℃培养96～120 h，收获病毒液反复冻融三次后，作为生产毒种。将生产毒种按2%比例接种MDCK细胞单层，37 ℃吸附1 h，补加维持液，37 ℃连续培养120 h，收获后反复冻融3次，12000 r/min离心30 min去除细胞碎片。将病毒液与50%的PEG6000等体积混合后，12000 r/min超滤离心1 h后，将沉淀用原毒液1/10体积的MEM细胞营养液复溶。用MDCK细胞进行病毒含量测定，按参考文献[6]进行。-20 ℃保存，备用。

1.2.2.2 基础免疫病毒液的制备 将MontanideTMGel 01 ST 水性佐剂按10%的比例与基础病毒液混合制成基础免疫病毒液，现用现配。

1.2.2.3 加强免疫病毒液的制备 将β-丙内脂按1/8000的比例加入基础病毒液中，4 ℃过夜灭活病毒。第二日37 ℃水浴2 h灭活β-丙内脂。将MontanideTMGel 01 ST 水性佐剂按10%的比例与灭活后的基础病毒液混合制成基础免疫病毒液，4 ℃保存，备用。

1.2.3 免疫和采血 将基础免疫病毒液分别经颈部肌肉注射接种2只山羊，2 mL/只，进行基础免疫。21 d后将加强免疫病毒液颈部肌肉注射接种2只山羊，2 mL/只，进行加强免疫。14 d后再按照与前次加强免疫相同剂量和接种途径加强免疫一次。14 d后颈动脉采血致死，分离血清，10000 r/min离心30 min，并用0.45 μm滤器过滤除菌，冻干后待检。

1.2.4 血清检定

1.2.4.1 无菌检验、支原体检验、外源病毒检验 按参考文献[5]进行。

1.2.4.2 特异性检验 采用微量细胞中和试验法测定抗狂犬病病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒的中和抗体，按参考文献[5]进行。

1.2.4.3 效价测定 采用微量细胞中和试验法测定血清中和抗体效价，血清制备实验室为主检室，并组织中国农业科学院特产研究所、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、山东齐鲁动物保健品有限公司三家具有标准物质效价标定经验的实验室参与协作标定，按参考文献[5]进行。将四家实验室测定中和抗体效价计算算术平均值作为该特异性阳性血清的中和抗体效价。

1.2.5 血清在含犬腺病毒组分的生物制品及生产用疫苗株检验中的应用试验 使用制备的阳性血清对2个不同批次的狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)、3个不同批次的犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒病、细小病毒病五联活疫苗和3个不同批次的狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)共8批含犬腺病毒组分的生物制品按照各自的质量标准[2-4,6]进行外源病毒检验和与CAV血清有关的鉴别检验。使用制备的阳性血清对3株犬腺病毒Ⅱ型疫苗株(CAV-Ⅱ(XN3株)、CAV-Ⅱ(BJ株)和CAV-Ⅱ(2RZ株))分别进行外源病毒检验[6]。

1.2.6 血清对不同的犬腺病毒毒株的中和指数测定 对3株犬腺病毒Ⅱ型疫苗株(CAV-Ⅱ(XN3株)CAV-Ⅱ(2RZ株)和CAV-Ⅱ(BJ株))，各分2组进行10倍系列稀释，将其中一组用制备的阳性血清进行中和，另一组加入等量生理盐水作为对照。接种已长成单层MDCK细胞的96孔细胞培养板，每组每个稀释度接种8孔，每孔100 μL。根据MDCK细胞的细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50，并计算中和指数。比较制备的阳性血清对不同犬腺病毒毒株的中和能力。

1.2.7 血清在间接细胞免疫荧光试验中的应用 将3株犬腺病毒Ⅱ型疫苗株(CAV-Ⅱ(XN3株)CAV-Ⅱ(2RZ株)和CAV-Ⅱ(BJ株))均稀释至100 TCID50，分别接种已长成单层MDCK细胞的96孔细胞培养板，培养96～120 h后丙酮固定。将制备的阳性血清进行1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200稀释，每个稀释度的血清分别加入不同腺病毒疫苗株培养的细胞板作为一抗，并在孵育兔抗羊IgG H&L(FITC)二抗后进行荧光观察。

2 结 果

2.1 免疫程序的探索及抗血清的制备 对生产毒种进行120 h连续培养后，收获病毒液200 mL。通过离心法去除犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)的MDCK细胞适应毒株基础病毒液中的细胞碎片，再经超滤浓缩、聚乙二醇沉淀后，收获18 mL基础病毒液，CAV-Ⅱ病毒含量达到109.0TCID50/mL。制备10 mL的基础免疫病毒液和10 mL的加强免疫病毒液。选择2只健康易感山羊，进行1次基础免疫和2次加强免疫后，犬腺病毒抗血清中和抗体效价达到预期(血清中和抗体效价期望值为≥1∶1024[2-3])。采集血液制备抗血清3000 mL，并冻干保存。

2.2 血清特异性检定结果 应用微量细胞中和试验法对制备血清的特异性进行检测，未检出犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬细小病毒和狂犬病病毒的抗体(表1)，表明该血清具有良好的特异性。

2.3 血清抗体效价测定结果 血清中和抗体效价测定结果见表2。根据四家实验室测定结果，确定血清中和抗体效价平均值为1∶9581。

表1 血清特异性检验结果Tab 1 Results of specificity test

SN:血清中和试验

SN: Serum neutralization test

表2 血清中和抗体效价测定结果Tab 2 Results of neutralization titer assessment

2.4 血清在检验中的应用结果 分别按照狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)、犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒病、细小病毒病五联活疫苗和狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)的质量标准对三种生物制品进行外源病毒检验和鉴别检验中与CAV血清有关的部分。按照《中国兽药典》的规定对CAV-Ⅱ(XN3株)、CAV-Ⅱ(BJ株)和CAV-Ⅱ(2RZ株)三株疫苗株进行外源病毒检验。结果表明，应用制备的犬腺病毒阳性血清可以很好的应用于三种活疫苗产品和三种生产用疫苗株的质量检验工作。结果见表3。

2.5 对不同的犬腺病毒毒株的中和指数测定结果

制备的犬腺病毒阳性血清对三株CAV-Ⅱ疫苗株的中和指数分别为106.0、106.7、106.0，表明阳性血清对三株CAV-Ⅱ疫苗株中和能力显著且无明显差异。结果见表4。

表3 血清在检验中的应用试验结果Tab 3 Results of application of antiserum in CAV products inspection

Y:按照产品质量标准进行检验，结果符合规定；"/":代表无此项目或未进行此项检验

Y: Test result is in compliance with respective quality standards; /: No this item

表4 CAV毒株的病毒含量测定结果及中和指数计算Tab 4 Results of Virus content and neutralization index assessment of various CAV strains

2.6 血清在间接细胞免疫荧光试验中的应用结果 通过将制备的阳性血清进行不同稀释度的稀释进行间接细胞免疫荧光染色，确定对于不同的犬腺病毒毒种，制备的阳性血清均在1∶800稀释时可达到最好的荧光染色效果。结果见图1。

A、G：CAV-Ⅱ(XN3株)组，血清1∶800稀释；B、H：CAV-Ⅱ(2RZ株)组，血清1:800稀释；C、I：CAV-Ⅱ(BJ株)组，血清1∶800稀释；D、J：CAV-Ⅱ(XN3株)组，血清1∶1600稀释；E、K：CAV-Ⅱ(2RZ株)组，血清1∶1600稀释；F、L：CAV-Ⅱ(BJ株)组，血清1∶1600稀释A、B、C、D、E、F表示荧光染色；G、H、I、J、K、L表示细胞固定前普通光镜观察A、G：CAV-Ⅱ(Strain XN3) group，1∶800 serum dilution；B、H：CAV-Ⅱ(Strain 2RZ)group，1∶800 serum dilution；C、I：CAV-Ⅱ(Strain BJ)group，1∶800 serum dilution；D、J：CAV-Ⅱ(Strain XN3) group，1∶1600 serum dilution；E、K：CAV-Ⅱ(Strain 2RZ)group，1∶1600 serum dilution；F、L：CAV-Ⅱ(Strain BJ)group，1∶1600 serum dilutionA、B、C、D、E、F represent fluorescent staining；G、H、I、J、K、L represent observation before cell fixation图1 MDCK细胞接种不同犬腺病毒毒种后细胞病变观察及间接免疫荧光观察Fig 1 CPE and indirect immunofluorescence observation of MDCK cells infected by different CAV-Ⅱ strain

3 讨论与小结

阳性血清是菌毒种及活疫苗检验中最重要的标准物质之一，无论外源病毒检验、特异性检验、鉴别检验、效力检验，特异性均是对阳性血清的首要要求。为了满足特异性要求，制备血清时选择了与犬种属关系较远的山羊作为免疫靶动物，降低了犬源病毒污染的概率，并且在筛选时严格选择无犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬细小病毒、狂犬病病毒等主要犬源病毒血清中和抗体的山羊，在血清制备完成后再次对上述病毒血清中和抗体进行了检定，充分保证了血清优良的特异性。

免疫原处理和免疫程序是获得较高抗体效价的关键。制备血清所使用的犬腺病毒Ⅱ型弱毒(BJ株)通过MDCK细胞连续传代获得了对MDCK细胞良好的适应性，并在收获基础病毒液后进行PEG沉淀和超滤浓缩，以此确保免疫原的抗原性、稳定性和浓度。使用动物专用的MontanideTMGel 01 ST水性疫苗佐剂，可以极大提高免疫效果[7]。在动物免疫阶段，动态监测犬腺病毒Ⅱ型血清中和抗体效价水平，确保血清制备结果可控。三所具有标准物质标定经验的实验室对制备血清协作标定中和抗体效价，证实了远高于期望值的血清效价。

狐狸脑炎活疫苗(CAV-2RZ株)、狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)和犬狂犬病、犬瘟热、副流感、腺病毒病(XN3株)、细小病毒病五联活疫苗三种不同的含CAV-Ⅱ型弱毒株组分的活疫苗产品，生产毒株不同且免疫动物种类不同，目前在市场上均已得到普遍应用。鉴于目前绝大多数犬腺病毒活疫苗产品均为CAV-Ⅱ型弱毒活疫苗[8-9]，故上述三种活疫苗产品可以很好的代表目前市场上的犬腺病毒类生物制品。生产用毒株的检验是生产合格的疫苗产品的关键环节，也是生物制品规程的重要规定。因此应用制备的犬腺病毒阳性血清对于上述几种代表性疫苗株和活疫苗产品进行检验并取得理想检验效果，可以很好的验证阳性血清的实际应用性能。中和指数测定也证实，制备的阳性血清不管对制备血清所使用的CAV-Ⅱ(BJ株)还是生产活疫苗所使用的CAV-Ⅱ(XN3株)和CAV-Ⅱ(2RZ株)均具有高效且相似的中和能力。间接细胞免疫荧光试验除了可以佐证血清高效且特异的中和能力外，还可发现在无CPE的情况下，仍然可以观察到明显的荧光信号，说明了用制备的阳性血清作为一抗进行CAV病毒含量测定或血清的CAV中和抗体效价测定等试验，可显著提高试验的灵敏度和精度。

兽用生物制品国家标准物质是国家负责标定和供应的用于兽用生物制品质量检验的标准物质，是提高兽用生物制品检验水平的重要环节。犬腺病毒阳性血清的制备和标定严格按照兽用生物制品国家标准物质相关规定[5]进行，并对血清效价这一主要特性值进行了协作标定，为犬腺病毒阳性血清国家标准物质的建立提供了重要基础。

研究表明，紧急预防犬腺病毒感染时可紧急接种高效价免疫血清[8]。国内也有应用高免血清进行治疗的报道[10]。制备的CAV血清中和抗体效价较高，中和能力优秀，能起到预防和治疗的作用，将为犬腺病毒疫区的紧急预防和治疗提供更好的思路。