高效液相色谱法测定兽药龙胆泻肝散中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量

栾庆祥，黄鑫，杨强，金晓峰，钱莘莘

(贵州省兽药饲料监察所，贵阳 550003)

龙胆泻肝散是由龙胆、栀子、黄芩、柴胡等10味中药制成的散剂，功能泻肝胆实火，清三焦湿热， 主治目赤肿痛，淋浊，带下，收录在2015年版《中华人民共和国兽药典》二部[1]。其药用历史悠久，临床应用广泛，但因各生产厂家的生产条件和工艺不尽相同，质量参差不齐，临床疗效也有所差异，因此，控制龙胆泻肝散的质量才能保证其临床的药用疗效。实验拟建立中药龙胆泻肝散中活性成分龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量测定方法，以控制龙胆泻肝散的质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器等(美国Agilent公司)；Waters 2695高效液相色谱仪，配四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器等(美国Waters公司)；ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱，XDB-C18(4.6 mm×250 mm , 5 μm)色谱柱(美国Agilent公司)；XS105型和ME802E型电子天平(瑞士METTLER公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂 龙胆苦苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110770-201013)；黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110715-201117)；栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110749-200613)；龙胆泻肝散(遵义县兽药厂，批号：120901，120902，120903，140101，140102，140103，140201，140202，140203，140204)；甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；实验用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相为甲醇(C)∶0.2%磷酸溶液(A)梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1；柱温为30 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品适量，以甲醇为溶剂, 配制混合对照品溶液, 其中含龙胆苦苷80.09 μg/mL、栀子苷50.30 μg/mL、黄芩苷99.53 μg/mL，即得。

表1 梯度洗脱条件Tab 1 Gradient elution conditions

2.3 供试品溶液的制备 取本品，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)20 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 按2015年版《中华人民共和国兽药典》二部中龙胆泻肝散项下处方的配比，除去龙胆、黄芩和栀子，然后制得阴性对照样品，取约0.67 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.5 系统适用性和专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液10 μL注入高效液相色谱仪。按2.1项下色谱条件测定，结果见图1，龙胆苦苷峰和栀子苷峰分离度大于2.0，黄芩苷峰与相邻组分峰分离度均大于2.0，理论板数以龙胆苦苷峰计不低于5000，阴性对照在与对照品和供试品色谱峰相同保留时间处无干扰峰；结果表明处方中的其他成分对龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的定量测定无干扰，专属性能满足检测要求。

2.6 稳定性试验 取同一对照品溶液，于制备后0、2、4、8、12、24 h注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件分别进行测定，记录各色谱峰面积，龙胆苦苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.31%，栀子苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.04%，黄芩苷峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.67%，表明溶液在24 h内稳定。

图1 专属性试验色谱图(A、B、C分别为对照品、供试品、阴性对照)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test(A: reference substances, B:Test samples, C: negative samples)

2.7 线性关系考察 取2.2项下制得的混合对照品溶液，分别进样 5、10、15、20、25、40 μL，测定各组分峰面积。以各组分质量浓度(C) 为横坐标,相应峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归。龙胆苦苷回归方程A=11.87C+1.40，r=0.9998,龙胆苦苷在0.400～3.203 μg范围内线性关系良好；栀子苷回归方程A=8.55C+25.56，r=0.9999,栀子苷在0.252～2.012 μg范围内线性关系良好；黄芩苷回归方程 A=14.08C+6.53，r=0.9999,黄芩苷在0.500～3.981 μg范围内线性关系良好。

2.8 准确度试验 采用加标回收的方法，在已知含量的龙胆泻肝散供试品中加入一定质量的龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷对照品，使其制备后在供试品中的量为其含量的100%，平行制备6份。再按照2.1项下色谱条件测定峰面积，计算出实际加入的标对照品的含量，用实际计算出来的加入量比上由称量得到的加入量，即得。取已测定栀子苷、龙胆苦苷和黄芩苷的龙胆泻肝散样品(批号：120902)6份，每份1 g，精密称定，每份分别精密加入2.003 mg/mL龙胆苦苷对照品溶液、3.850 mg/mL栀子苷对照品溶液和7.100 mg/mL黄芩苷对照品溶液1.0 mL，按2.3项下制备供试品溶液，精密吸取10 μL上机测定。龙胆苦苷回收率为90.5%～92.4%，平均回收率为91.5%，RSD为0.77%；栀子苷回收率为88.1%～92.4%，平均回收率为90.2%，RSD为1.58%；黄芩苷回收率为92.8%～96.7%，平均回收率为94.6%，RSD为1.74%；结果见表2。

表2 龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷加样回收率试验Tab 2 Recovery results of gentiopicroside, geniposide and baicalin

2.9 精密度试验 取龙胆泻肝散供试品(批号：120902)溶液，精密吸取10 μL，按2.1项下色谱条件进样，重复进样6次，测定龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的峰面积，计算得出龙胆苦苷峰面积的RSD为0.78%，栀子苷峰面积的RSD为0.79%，黄芩苷峰面积的RSD为0.70%，结果见表3。

表3 精密度试验Tab 3 Precision test

续表

2.10 耐用性试验 取2.8准确度测定项下制得的样品，按既定流动相梯度洗脱条件和流速不变，在Waters2695和Agilent 1260高效液相色谱仪上分别使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱和Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱，于20℃、30℃、40℃条件下进行测试，考察方法的耐用性，结果表明该方法能够耐受不同液相色谱仪、色谱柱、柱温等因素的小范围变化，测定龙胆泻肝散中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量无显著差异，说明耐用性良好。

2.11 样品测定 取不同批号的龙胆泻肝散，分别按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL上机测定峰面积，根据上述拟合的曲线方程外标法定量，计算出供试样品中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量，结果见表4。

表4 供试样品中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷含量测定结果Tab 4 Conten determination results of gentiopicroside, geniposide and baicalin

3 讨论与结论

3.1 含量测定成分的选择 龙胆泻肝散是由龙胆、栀子、黄芩等10味中药制成的散剂，其中龙胆为君药，栀子和黄芩为臣药[2]。《中国兽药典》2015年版中龙胆、栀子和黄芩质量控制的目标成分分别是龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷；龙胆苦苷是龙胆的主要活性成分之一，具有保肝、利胆、抗炎、抗过敏、健胃等多种药理作用[3-5]；栀子苷具有降血压、改善胃功能、保护肝脏、促进胆汁分泌、镇痛镇静等作用，在医药、农业方面有重要作用[6]；黄芩苷具有强效的清除氧自由基、抗过敏反应、抑制炎性分子、病毒和细菌、解痉、利尿作用[7]；且在《中国兽药典》2015年版中龙胆泻肝散质量控制的目标成分是龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷，所以龙胆泻肝散含量测定的成分选择龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷。

3.2 样品前处理方法的选择 龙胆苦苷和栀子苷为环烯醚萜苷类化合物，易溶于水和甲醇，提取方法一般采用回流法[8-9]，黄芩苷为黄酮类化合物，易溶于甲醇，提取方法一般采用回流法和超声法[10]，参考《中国兽药典》2015年版二部龙胆泻肝散含量测定项下前处理方法，采用50%甲醇超声提取20 min，结果表明该方法能够较完全的提取出龙胆泻肝散中的龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷。

3.3 检测波长的选择 分别取龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的对照品溶液，经紫外-可见分光光度法测定，龙胆苦苷在271 nm 处有最大吸收，黄芩苷在278 nm 处有最大吸收，栀子苷在237 nm 处有最大吸收，本试验选取254 nm同时测定这3个组分，结果在选定的条件下3组分均有较高的紫外吸收值，且各组分分离度良好，故选择检测波长为254 nm。

采用高效液相色谱法测定龙胆泻肝散中龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷的含量，该方法简单、快速，准确度高，重复性好，可有效控制该制剂的中主药龙胆、栀子和黄芩的质量，通过对三个批次的10个实际样品的测定，龙胆苦苷含量为2.01～3.57 mg，栀子苷含量为3.39～3.98 mg，黄芩苷含量为6.71～7.98 mg，均满足《中国兽药典》2015年版二部中龙胆泻肝散项下对龙胆苦苷、栀子苷和黄芩苷含量的要求，说明制剂生产过程中质量稳定。