UPLC-PDA法测定蒲公英提取物中咖啡酸的含量

魏秀丽，徐恩民，刘霄飞，李有志*，张秀英，王海军

(1.山东省兽药质量检验所，济南250022；2.中国兽医药品监察所，北京100081；3.山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南250022；4.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102206；5.北京市中兽药工程技术研究中心，北京 102206)

蒲公英为菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand-Mazz、碱地蒲公英TaraxacumborealisineseKitam或同属数种植物的干燥全草。味甘、微苦，性寒，无毒，用于疔疮肿毒、乳痈、咽痛、湿热黄疸、热淋涩痛。蒲公英同时含有蛋白质、脂肪、碳水化合物等，有丰富的营养价值，是药食兼用的食物。药材及相关制剂被收录于中华人民共和国药典和兽药典[1-2]。由于其良好的治疗效果和亲民的价格，蒲公英提取物在兽药中的研究也成为热点，对其有效成分进行质量控制成为必然。蒲公英主要含有黄酮类、酚酸类、糖类、倍半萜内酯类等成分，其中以咖啡酸为代表成分。

有文献报道采用薄层色谱法(TLC)为蒲公英提取物制定定性鉴别方法；采用高效液相色谱(HPLC)法测定其咖啡酸含量[1-8]。前者耗时较长，实验室进行了改进。本文对经水提醇沉的蒲公英提取物，采用超高效液相色谱法对其有效成分咖啡酸进行定性和定量检测，方法经济快速，满足日常检测需求，为下一步蒲公英提取物的工艺调整和优化方案的筛选提供最快速的检测方法，为制定检测标准提供方法借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器 分析天平：感量0.00001g；仪器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色谱仪。

1.2 药品及试剂 咖啡酸标准品，批号110885-201703，含量99.7%，中国食品药品检定研究院。甲酸、甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；超纯水。蒲公英提取物为水提醇沉，北京生泰尔科技股份有限公司小试生产的产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流动相A：乙腈；流动相B：水溶液(0.4%磷酸)，进行梯度洗脱；流速：0.35 mL/min；进样量：5 μL；柱温：35 ℃。二极管阵列检测器，检测波长为323 nm。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件表Tab 1 Gradient elution condition table

2.2 样品制备

2.2.1 样品 蒲公英提取物

2.2.2 标准储备液的制备 精密称取咖啡酸对照品9.36 mg，加甲醇至100 mL，制成100 μg/mL的溶液，作为咖啡酸标准储备液。

2.2.3 标准工作液的制备 取适量标准储备液，用初始比例流动相稀释，制备成系列浓度为： 1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL标准工作液，并绘制标准曲线。

2.2.4 蒲公英提取物样品的制备 精密称取蒲公英提取物样品约0.5、0.2、0.1、0.05 g，置15 mL离心管中，加5%甲酸甲醇溶液溶解并定容至10 mL，超声30 min，5000 rpm.离心10 min，过滤至15 mL离心管中，作为样品初始液；分别精密量取相应浓度的样品初始液适量，用初始比例流动相稀释5倍，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，上机测试。

2.3 方法线性考察

2.3.1 专属性试验 咖啡酸对照品和蒲公英提取物样品待测液，在2.1项条件下，色谱保留时间为3.45 min左右见图1-图2。光谱图见图3-图4。

图1 10ug/mL咖啡酸对照品色谱图Fig 1 Chromatogram of 10ug/mL caffeic acid reference substance

图2 蒲公英提取物样品中咖啡酸色谱图Fig 2 Caffeic acid chromatogram of dandelion extract sample

图3 10ug/mL咖啡酸对照品光谱图Fig 3 Spectra of 10ug/mL caffeic acid reference substance

图4 蒲公英提取物样品中咖啡酸光谱图Fig 4 caffeic acid spectrum of dandelion extract sample

由光谱图可以看出对照品和样品中咖啡酸的紫外最大吸收波长分别为324.4、323.2 nm。测试比较323与324 nm波长的峰面积，323 nm处咖啡酸峰面积更大些，见表2。定量检测时选择323 nm波长。

表2 不同波长的峰面积比较Tab 2 Comparison of pesk area of different wavelengths

2.3.2 咖啡酸标准曲线 在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可以有效地分离各杂质峰，在1～100 μg/mL的范围内标准曲线方程为y=70200x+38300，Y为咖啡酸峰面积，X为咖啡酸的浓度，其相关系数R2为0.999，线性良好。见图5。

图5 咖啡酸标准曲线图Fig 5 Standard curve of caffeic acid

2.3.3 重复性试验 配制10 μg/mL咖啡酸对照品溶液，重复6份，进样，计算咖啡酸峰面积RSD为0.82%。

2.3.4 精密度试验 取10 μg/mL咖啡酸对照品溶液，重复进样6次，计算咖啡酸峰面积RSD为0.51%。

2.3.5 稳定性试验 取“2.3.4”项下10 μg/mL咖啡酸对照品溶液，在室温放置3、6、12、24 h;在4 ℃放置3、6、12、24 h后，各进样5 μL，计算咖啡酸峰面积RSD为0.73%。

2.3.6 检测限和定量限 0.25 μg/mL咖啡酸对照品溶液信噪比>3为检出限，1 μg/mL 咖啡酸对照品溶液信噪比>10为定量限。

2.3.7 取样量及校正方法的选择 称取蒲公英提取物样品约0.5、0.2、0.1、0.05 g，各2个平行，处理后，约为0.5 g称样量的上机溶液的峰面积与10 μg/mL的对照品溶液的峰面积较为接近，其他的峰面积按比例减小，最终选取5 μg/mL的对照品溶液对约0.2 g称样量的上机溶液进行定量计算，平均值为0.77 mg/g，与按标准曲线含量计算结果0.785 mg/g相差0.015 mg/g，随着取样量的减少，两者计算的偏差越来越大，见表3，最终选择称取0.2 g样品进行处理，并按照相近峰面积浓度的单点计算含量。

表3 不同校正方法的含量结果比较Tab 3 comparison of content results of different correction methods

2.3.8 添加回收试验 精密称取蒲公英提取物样品约0.1 g，置15 mL离心管中，加8 mL咖啡酸对照品储备液，加5%甲酸甲醇溶液2 mL，同供试品同样处理上机测试。回收率在94%～101%的范围内，满足准确度的要求。

表4 咖啡酸添加回收率结果Tab 4 Results of recovery for caffeic acid

3 讨论与结论

实验选择了超高效液相色谱法对蒲公英提取物中的咖啡酸进行定性和定量测定。与2015版中国兽药典[1]、中国药典[2]中蒲公英的检测方法和文献报道方法相比[3-8]，一是鉴别采用了光谱法，省却了薄层色谱法鉴别[1-2]繁琐的操作，节省了多种如乙酸乙酯、乙酸丁酯等有机溶剂的使用，保护了环境；二是采用了UPLC，定量的色谱图出峰保留时间提前至3.5 min左右，运行时间短12 min，流速0.35 mL/min，比文献HPLC方法[1-8]节省了大量的流动相；三是摒弃了甲醇：磷酸盐缓冲液等[1-8]作为流动相，降低了色谱柱因磷酸盐易堵的风险。

使用超高效液相色谱-PDA检测器，对蒲公英提取物中的咖啡酸进行定性和定量测定，方法准确度高，灵敏度好，经济可行，绿色环保，并为生产企业下一步调整优化蒲公英提取物的生产工艺提供快速的检测方法。