牛结核杆菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表达及抗原反应性分析

姜秀云，董阳，包艳红，张建宁，方诗文，金海玲，王宁，马红霞*

( 1.吉林农业大学生命科学学院，长春130118；2.吉林农业大学动物科技学院，长春130118；3.长春科技学院生物食品学院，长春130600)

牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛结核杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的牛、鹿等多种动物及人共患的慢性细菌性疫病，是世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties, OIE)规定的B类疫病之一。人通过与患病动物的密切接触[1]及饮用未消毒的乳制品[2]而患病。另外，人结核分枝杆菌也可传播给牛和其他动物[3-4]，从牛乳[5]和不同动物组织[6-7]中可广泛地分离出结核分枝杆菌。可见，致病性结核杆菌可在人和动物之间的相互传播，给结核病的控制带来了相当的困难。目前，检测牛结核病唯一的方法是OIE指定的牛结核菌素(Purified Protein Derivative，PPD)变态反应[8]，但是该方法存在较高的非特异性反应，由此造成不必要的经济损失令许多发展中国家难以承担。而现有的临床上唯一应用的疫苗——卡介苗(Bacillus of Calmette and Guerin，BCG)又不能用于牛的接种。因此，畜牧业生产中亟需适于牛结核病诊断和预防的新型抗原和疫苗。

MPB70和ESAT-6是结核分枝杆菌分泌到细胞外的主要蛋白质，MPB70是菌体表面蛋白，但BCG中表达水平低下或不表达[9]，ESAT-6是菌体的毒力因子，由RD1区基因编码，只存在于致病结核分枝杆菌中，但不存在于环境分枝杆菌和BCG中，已被提议作为区分感染和接种动物试验候选抗原[10]。另外，MPB70中存在多个Th1型细胞抗原表位[11]，能诱导免疫动物产生IFN-γ[12]，ESAT-6能够引起显著的体液免疫和细胞免疫[13]及有效的保护作用[14]。可见，MPB70和ESAT-6均是结核病新型诊断抗原和疫苗的靶点。目前，人们越来越关注血清学方法与传统的细胞介导免疫技术相结合，以提高结核感染的检出率，尤其是利用融合蛋白或多重抗原来提高血清学诊断的敏感性[15-18]。因此，将MPB70和ESAT-6两个特异性抗原基因通过重叠延伸 ( Splicing by Overlapping Extension，SOE) PCR技术相融合，并进行原核表达及抗原反应性分析，为融合蛋白MPB70-ESAT-6用于牛结核病的诊断及疫苗研制打下基础。

1 材料与方法

1.1 基因、载体及菌株 pGEM-T-70和pGEM-T-esat-6由吉林省新兽药研发与创制重点实验室构建；pET28a(+)为Novagen公司产品；T-Vector pMD19购于宝日医生物技术(北京)有限公司；EscherichiacoliDH5ɑ、E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)为吉林省新兽药研发与创制重点实验室留存。

1.2 酶与主要试剂BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA Ligase、LATaqDNA聚合酶、Pyrobest DNA Polymerase、DNA Markers及DNA凝胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品；卡那霉素(Kanamycin，Kan)、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)均Amresco公司产品；异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)为Invitroge公司产品；Ni-NTA Agarose为QIAGEN公司产品；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)为Roche公司产品；牛结核阳性血清采自结核病变牛；HRP标记羊抗牛IgG为北京百奥莱博科技有限公司产品。

1.3 引物的设计与合成 依据mpb70、esat-6的碱基序列，利用生物软件设计PCR引物，序列见表1，由吉林省库美生物科技有限公司合成。引物P1-70、P2-esat-6中分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of Primer

1.4 融合基因的扩增 首先利用pGEM-T-70、pGEM-T-esat-6为模板，以P1-70和P2-70、P1-esat-6和P2-esat-6为引物，应用Pyrobest DNA Polymerase分别对mpb70与esat-6基因进行PCR 扩增。再以mpb70和esat-6的扩增产物为模板，以P1-70-和P2-esat-6为引物，通过LATaqDNA对mpb70-esat-6进行扩增。扩增产物利用凝胶回收纯化试剂盒纯化。

1.5 mpb70-esat-6的克隆和序列分析 将mpb70-esat-6和T-Vector pMD19用Solution I连接，构建重组质粒pMD-70-esat-6，转化至感受态E.coliJM109中，振荡培养1 h，于固体LB培养基(100 mg/L Amp)中培养。转化菌于液体LB培养基中培养过夜。提取质粒，进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，重组质粒由吉林省库美生物科技有限公司予以测序。

1.6 重组表达载体的构建与鉴定 以BamHⅠ、EcoRⅠ酶切pMD-70-esat-6和pET28a(+)，回收产物通过T4 DNA Ligase连接，构建pET-70-esat-6。转化至E.coliBL21(DE3)中，于LB(50mg/L Kan)固体培养基中培养过夜。转化菌经液体LB培养后，提取质粒并酶切分析。

1.7 mpb70-esat-6的诱导表达及鉴定 将重组菌接种于含Kan的液体LB培养基中，37 ℃ 振荡培养至OD600nm≥0.65，用1 mmol/L IPTG诱导，而后每小时留存少量菌液，共诱导7 h。将留存的菌液OD600nm调至0.65，吸菌液1.0 mL，离心后，于菌体中加双蒸水80 μL。加上样缓冲液，煮沸处理后，进行SDS-PAGE。

1.8 MPB70-ESAT-6表达形式分析 将表达菌株接种于200 mL液体LB中培养，经IPTG诱导4 h后，离心收集菌体。超声破碎后，离心分离上清与沉淀，对上清和沉淀进行SDS-PAGE。

1.9 MPB70-ESAT-6的反应性分析 采用Western blotting分析MPB70-ESAT-6的反应性。诱导后的表达菌→超声破碎→裂解液上清→Ni-NTA Agarose柱纯化→SDS-PAGE→转膜→BSA封闭后，再依次进行如下反应：牛结核阳性血清→HRP标记羊抗牛IgG→联苯胺反应。

2 结 果

2.1 融合基因扩增产物mpb70、esat-6及mpb70-esat-6 扩增结果如图1所示。图中可见mpb70、esat-6和mpb70-esat-6 DNA片段分别是545 bp、341 bp、841 bp，与预期大小相一致。

1-3: 分别为mpb70、esat-6和mpb70-esat-6 基因的 PCR产物; M: DNA Marker1-3: PCR products of mpb70, esta-6 and mpb70-esat-6 genes, respectively; M: DNA Marker /DL2000 图1 mpb70, esat-6和mpb70-esat-6的PCR扩增Fig 1 PCR amplification of mpb70,esat-6 and mpb70-esat-6 genes

2.2 mpb70-esat-6的克隆与鉴定 mpb70-esat-6与载体pMD19连接，获得了pMD-70-esat-6， 经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后，电泳结果见图2。图中可见约2690 bp的pMD19和841 bp的mpb70-esat-6。序列测定后分析显示，mpb70-esat-6 融合基因的大小为841 bp，与预期大小一致，而且没有碱基的插入、缺失及替换现象，成功地得到了牛结核杆菌mpb70-esat-6融合基因。

2.3 原核表达质粒的构建与鉴定 mpb70-esat-6和载体pET28a(+)连接，构建了pET-70-esat-6，经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，获得了约5300 bp的pET28a(+)和841 bp的mpb70-esat-6(图3)。

2.4 SDS-PAGE分析E.coliBL21(DE3)中的pET-70-esat-6经IPTG诱导各时间的表达结果如图4所示。图中可见mpb70-esat-6得到了表达，MPB70-ESAT-6的相对分子量约为27.2 ku，诱导后表达量明显增加，4 h后达到最高，在超声裂解液的上清和沉淀中均存在，说明MPB70-ESAT-6以可溶性和包涵体两种形式获得了表达，这种可溶性表达有利于后续的纯化。而pET28a(+)E.coliBL21(DE3)中则没有见到该蛋白的表达。

2.5 MPB70-ESAT-6的反应性分析 mpb70-esat-6融合基因表达的MPB70-ESAT-6融合蛋白Western blotting分析结果见图5，图中27 ku 处存在一条明显的蛋白印迹带，表明表达的MPB70-ESAT-6能够与牛结核阳性血清发生反应，且有着良好的反应性。

1-2: pMD-70-esat-6的酶切产物; M: DNA Marker DL20001-2: Products of pMD-70-esat-6 digested by enzyme; M: DNA Marker DL2000图2 重组质粒pMD-70-esat-6的酶切鉴定Fig 2 Restriction analysis map of pMD-70-esat-6

M1: DNA Marker DL2000; 1: pET-70-esat-6; 2: pET-70-esat-6的酶切产物; M2: λ DNA digested with Hind ⅢM1: DNA Marker DL2000; 1: pET-70-esat-6; 2: Products of pET-70-esat-6 digested by enzyme; M2: λ DNA digested with Hind Ⅲ图3 原核表达质粒的酶切鉴定Fig 3 Restriction analysis map of pET-70-esat-6

1: pET-28a(+)在E.coli BL21中诱导7 h;2-9: 分别是pET-70-esat-6在E.coli BL21中诱导0～7 h; M: 蛋白质Marker; 10: pET-70-esat-6在E.coli BL21中诱导后裂解的沉淀;11: pET-70-esat-6在E.coli BL21中诱导后裂解的上清1: pET-28a(+) expression result in E.coli BL21 with IPTG induced 7 h, as control; 2-9: pET-70-esat-6 expression results in E.coli BL21 with IPTG induced 0～7 h, respectively; M: Protein Marker;10: Cleavage liquid precipitate of pET-70-esat-6 in E.coli BL21 with IPTG induced; 11: Cleavage liquid supernatant of pET-70-esat-6 in E.coli BL21 with IPTG induced图4 mpb70-esat-6 在E.coli BL21中的表达Fig 4 mpb70-esat-6 fusion gene recombinant expression plasmid expressed by prokaryotic expression vector in E.coli BL21

1-3: MPB70-ESAT-6; M: 蛋白质Marker1-3: MPB70-ESAT-6; M: Protein Marker图5 MPB70-ESAT-6 的Western blotting分析Fig 5 Western blotting analysis of the MPB70-ESAT-6 fusion protein

3 讨 论

迄今为止，动物结核病一直在采取检疫-隔离-淘汰的防制策略，但始终未能从根本上得以控制。究其原因，一方面是存在结核动物的漏检情况，另一方面尚无实用的疫苗。因此，新型、安全、高效结核病疫苗和敏感、特异检测抗原的研制，以及简便、快速、易行诊断方法的建立则一直倍受注目。

在结核病免疫学诊断研究中，有报道指出，牛结核杆菌MPB70、MPB83、MPB63、ESAT-6和CFP10等可能是结核病血清学诊断最为有用的抗原[19]。MPB70、MPB83、ESAT-6、CFP10四种抗原在多重ELISA分析中的敏感性为74.2%，特异性为94.9%[15]，MPB70检测的阳性血清抗体效价有50%达1∶64000[16]。MPB83/MPB70融合蛋白对自然感染的结核牛血清检测的敏感性为63%，特异性为98%[17]。p22(主要是MPB70和MPB83的复合物)ELISA对赤鹿检测的敏感性和特异性分别为99.02%和70.1%[18]。

研究发现，与ESAT-6相比，PE/PPE肽-ESAT-6融合蛋白的免疫应答增强，攻毒后，能诱导CD4+T细胞分泌IL-2+/IFN-γ+，且脾脏中的菌落形成单位低于ESAT-6[20]。ESAT-6 与IgG1 Fcγ的融合能够靶向APC的FcγR，从而增强免疫原性[21]。可见，融合蛋白或多重抗原在结核病的诊断和疫苗的研究中有着良好的应用前景。

本研究利用45个核苷酸Linker将牛结核杆菌mpb70和esat-6两个保护性抗原基因融合，通过(Gly4Ser)3的柔性肽将MPB70和ESAT-6连接并隔离，以防两个蛋白在空间结构折叠时产生干扰。本研究成功地获得了mpb70-esat-6融合基因，序列分析表明碱基序列准确无误。由此构建了mpb70-esat-6的原核表达重组质粒，并在E.coli中表达了MPB70-ESAT-6，且具有良好的抗原反应性，为进一步研究MPB70-ESAT-6作为牛结核病的诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础。