高致病性禽流感监测预警模式的建立与应用

2019-04-09莫昆

中国畜禽种业 2019年3期

莫昆

（云南省文山州动物疫病预防控制中心 663000）

1 背景及目的意义

高致病性禽流感是由A型流行性感冒病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）传染病，可以直接感染人类，并造成死亡。至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9亚型。其中，高致病性禽流感H5N1亚型和2013年3月在人体上首次发现的新禽流感H7N9亚型尤为引人关注，不仅造成人类伤亡，同时重创了家禽养殖业。2017年6月，云南省文山州首次出现了4例人感染高致病性禽流感H7N9亚型病例，导致全州人民群众生命财产安全和公共卫生安全受到严重威胁，同时也造成社会的恐慌和家禽养殖业的重大损失，2017年全州存栏家禽1404.4万羽，大部分是以千家万户散养为主的生产方式，普遍存在养殖设备简陋、技术落后等问题，不具备科学防控禽流感的预警能力，一旦发生疫病极易造成流行和蔓延，从而引发重大的经济损失和人群危害。再者，文山州地处边疆，与越南边境线长达438km，境外疫情复杂而且高发，境外疫病传入风险较高，针对文山州高致病性禽流感防控的严峻形势，文山州动物疫病预防控制中心在云南省动物疫病预防控制中心及文山州农业局的领导和支持下，开展了文山州高致病性禽流感监测预警模式的研究，以努力确保不发生区域性重大动物疫病和不发生重大畜产品安全事件为目标，围绕建立和提高全州禽流感科学防控预警能力，提高边境沿线防疫屏障的疫情防堵能力为核心任务，以实现“防风险、保安全、促发展”为总体目标任务。项目主要实施在全州边境地区、养殖密集区、老疫区、候鸟迁徙或栖息地等高风险地区，依托具备资质的县级兽医实验室5个，设立禽流感疫情监测网点52个，引进分子生物学检验新技术，配备相关设备，建立文山州第一个禽流感等疫病的病原学监测预警的分子生物学检测（PCR）实验室，承担全州疫情监测、上报、流行病学分析等关键技术，构建了文山州禽流感监测预警体系，并成功控制和处置了2017年H7N9亚型流感疫情。

2 实施的内容

（1）分子生物学检测室的建设。

（2）建立高致病性禽流感分子生物学检测方法（以下简称PCR检测）。

（3）设置监测点，建设高致病性禽流感监测网络。

（4）构建高致病性禽流感监测预警模式。

（5）运用监测预警模式开展高致病性禽流感监测预警。

3 项目实施的技术路线、方法步骤及保障措施

3.1 技术路线

3.2 方法步骤

3.2.1 PCR检测室的建设

2016年起，为提高动物疫病防控能力，文山州动物疫病预防控制中心积极筹措资金进行PCR检测室的建设。

3.2.2 设置监测点，确立监测方案

根据HACCP危害分析和关键控制点原理，结合文山州实际，科学设置文山州高致病性禽流感监测点，并制定监测方案。

3.2.3 建立高致病性禽流感PCR检测方法

PCR检测技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。检测步骤包括病毒核酸提取、PCR扩增、凝胶电泳、成像。

（1）样品采集：把采集的咽喉、泄殖腔、环境、运输工具棉拭子分装在盛有保存液的2ml离心管中密封，认真填写采样表，于采样后20d内派专人专车运送至兽医实验室。

（2）病毒核酸提取，采用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒。①收集200μl样品，转入1.5ml离心管中；②加200μl Buffer V-L（病毒裂解液），漩涡振荡混合均匀，静置5分钟；③加75μl Buffer V-N（蛋白去除液），漩涡振荡混合均匀，12000×g离心5min；④将上清转移到新的2ml离心管中，加300μl异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6～8次，混合均匀；⑤将制备管置于2ml离心管中，取步骤④中的混合液移入制备管中，6000×g离心1min；⑥弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加500μl Buffer W1A（洗涤液），室温静置1min，12000×g离心1min；⑦弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800μl Buffer W2（去盐液），12000×g离心1min；⑧将制备管置回到2ml离心管中，12000×g离心1min；⑨将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40～60μl Buffer TE,室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA/RNA。

（3）PCR扩增，引物由云南省动物疫病预防控制中心提供。

凝胶电泳。①凝胶制作：将1.2g西班牙琼脂糖加入120ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，加入6μl花青素（体外染色剂），待琼脂糖溶液冷却至60℃左右将其倒入事先准备好的胶板中，室温冷却凝固，完全凝固后将凝胶置入电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1～2mm，小心垂直向上拔出梳子；②上样：用移液器吸取8μl扩增产物与6×loading buffer混匀后小心加入凝胶中的点样孔，吸取3μl Marker 2000加入另一点样孔；③电泳：打开电泳仪开关，由于DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场的作用下将向正极移动，电泳约20～35min。

成像：将电泳后的凝胶置于凝胶成像仪，观察并记录实验结果。

3.2.4 构建高致病性禽流感监测预警模式

以监测点为基础，依托PCR检测室，运用样品采集、PCR检测、免疫抗体检测、流行病学调查等方法，认真开展高致病性禽流感监测，及时分析文山州高致病性禽流感分布规律，建立科学有效、切合文山州实际的高致病性禽流感监测预警模式。

3.2.5 开展高致病性禽流感PCR检测

每月开展一次活禽交易市场高致病性禽流感A型检测工作。检测出的阳性样品派出专人专车送省动物疫病预防控制中心确认并定型。

3.2.6 开展高致病性禽流感免疫抗体检测

为准确评估高致病性禽流感免疫效果发现，高致病性禽流感免疫薄弱点，及时排除疫情隐患，采用定期和紧急两种方式进行高致病性禽流感免疫抗体检测，定期检测采用集中检测和常规检测相结合的方法开展检测，集中检测每年开展2次，主要对文山州春、秋两防免疫效果进行评估，常规检测每月开展1次，主要对规模养殖场的免疫效果进行评估，紧急检测主要为处置疑似高致病性禽流感疫情提供科学依据。

3.2.7 开展流行病学调查

通过调查禽流感在文山州的分布及危害程度来制定切合文山州实际的科学有效的防控措施。在人口密集、规模养殖集中的文山市和边境通道多，边民互市活跃的麻栗坡县、富宁县的重点区域，选择规模养殖场和活禽交易市场进行流行病学调查和采集样品，通过定期、连续采集调查点中的相关数据，为疫情分析评估提供信息。

3.2.8 分析文山州高致病性禽流感分布规律

根据长期检测结果分析，文山州家禽所感染的高致病性禽流感亚型，以及各种亚型在时间、空间的分布规律。

3.3 保障措施

3.3.1 成立课题实施小组

为保证项目顺利完成，成立了项目实施小组，讨论制定实施方案和技术路线，关键技术研究，各环节的试验设计、经费使用、进度安排等。

3.3.2 经费保证

为保障项目的顺利实施，共筹措180万元资金投入该项目。

4 项目实施结果

4.1 建成一个PCR检测室

PCR检测室于2017年9月建成并投入使用。PCR检测室内设试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区4个功能区，配备梯度PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、台式多功能离心机、生物安全柜等24台套仪器设备，可开展禽流感、鸡新城疫等病毒核酸检测。

4.2 设立52个监测点

结合文山州实际，设置了以文山市城区活禽交易市场为主、各县城区活禽交易市场为辅、兼顾规模养殖场的监测点，目前，文山州共设立52个监测点。

4.3 完成高致病性禽流感PCR检测方法的建立工作

2017年8月，由云南省省动物疫病预防控制中心提供盲样，并派出技术人员到现场指导，经省、州技术人员多次试验验证，最终建立了适合文山州动物疫病预防控制中心兽医实验室PCR检测室实际的高致病性禽流感PCR检测方法，确保了检测的准确性、可靠性。

4.4 建立了科学的高致病性禽流感监测预警模式

（1）是将集中监测和常规监测相结合、常规监测与应急监测相结合、抗体监测和病原监测相结合、实验室监测与流行病学调查相结合，认真分析、评估疫情发生风险，预测疫情流行态势，及时获得疫情预警信息。

（2）是突出加强对边境地区、州府所在地、县市城区所在地、养殖密集区的监测，及时发现和掌握重大动物疫情隐患，严格疫情报告和诊断。

（3）是增加监测比例、加大监测力度，及时汇总分析监测结果，全面评估发生疫情的风险，力求准确预测疫情发生和流行的态势，科学指导防控工作。

4.5 高致病性禽流感监测预警模式的应用

4.5.1 定期开展监测与流行病调查

实验室于2017年9月开始每月进行1次流感病原学检测，并对检测出高致性禽流感病原学阳性的监测场点开展流行病学调查。至2018年3月，共检测禽流感病原学样品4901份，检出A型禽流感阳性样品279份，检出的阳性样品经省级兽医实验室检测确认，共有A型阳性248份，其中H5亚型8份。8份H5亚型流感涉及到文山、丘北两个县市的6个活禽交易市场，经调查未发现存在临床症状的病禽。

2017年在文山州104个乡镇、638个村、1104个场户开展了高致病性禽流感免疫效果定期检测，抽检了10414羽份血清样品，合格8111份,合格率为77.89%，达到了群体免疫合格。

4.5.2 紧急开展监测与流行病学调查

2018年1月23日至2月4日，马关县动物疫病预防控制中心于在马白镇下寨村委会坝尾村进行禽流感流行病学调查采样时，发现养鸡户田立宁家养殖场的鸡发病快、死亡率高情况，经采样送省、州进行PCR检测，结果为禽流感H5N6阳性。为准确评估马关县马白镇高致病性禽流感免疫效果，文山州动物疫病预防控制中心派出专业技术人员，在马关县动物疫病预防控制中心紧急开展免疫抗体检测，H5亚型免疫抗体检测共检测禽血清128份，合格69份（抗体效价5log2以上），合格率53.9%；H7亚型免疫抗体检测共检测禽血清120份，合格48份（抗体效价5log2以上），合格率40%。

表2 高致病性禽流感病原学检测情况

图1 文山州禽流感病原时间分布情况

图2 文山州禽流感病原空间分布情况

4.5.3 初步分析出文山州高致病性禽流感的分布、流行规律

时间分布情况：从图1中可以看出，文山州家禽间禽流感病原感染以低致病性禽流感H9N2亚型为主，2017年9月至2018年1月期间未检测出高致病性禽流感阳性禽，2018年2月、3月分别检测出1份、7份高致病性禽流感H5N1阳性禽，可分析出高致病性禽流感H5N1亚型在文山州有感染率上升的趋势。

从图2中可以看出，文山州家禽间禽流感病原感染主要分布于文山市、西畴县、麻栗坡县、丘北县、广南县，其中以文山市家禽间带毒率最高。

根据2017年9月到2018年3月的监测与调查结果分析，文山州禽流感病原感染以低致病性H9亚型流感为主，H9亚型流感每个月均有检出，从区域上看，H9亚型流感主要分布在文山市、西畴县、麻栗坡县、丘北县、广南县，污染面达到62.5%；2017年9月到12月文山州未检测出高致病性禽流感阳性禽，2017年9月到2018年3月文山州均未检测出H7亚型流感阳性禽，2018年1月到3月均检出高致病性H5亚型流感阳性禽，从区域上看，H5亚型流感主要分布在文山市、丘北县、马头县，污染面达到37.5%。

4.5.4 及时上报监测预警报告

2017年9月到2018年3月，根据高致性禽流感的监测结果，向州农业局提供禽流感疫情监测预警报告4份，并指导各县及时处置高致性禽流感病原学检测阳性禽及其同群禽。

4.5.5 为科学防控高致病性禽流感提供保障

在文山州8县推广应用快速、敏感的高致病性禽流感的抗体监测方法，扩大了监测范围的深度和广度。各县均能监测禽免疫后的免疫效果，根据免疫效果实施科学防控对策；并能及时掌握疫情动态，一旦发现疫情，尽早检测做出准确诊断，严格实施有效防控措施，防止疫情扩散传播，为当地养殖业发展提供技术保障。通过开展病原学PCR检测，及时发现感染高致病性禽流感的家禽，发出监测预警，提出防控建议，为上级主管部门、各县市做好疫情处置提供快速准确的防控依据。

5 创新点

5.1 文山州禽流感监测首次拓展到环境样品

项目实施前，文山州的动物疫病监测样品以血清为主，不能监测组织样品和环境样品，实施该项目后，文山州可以开展组织样品和环境样品的监测，填补了因畜禽死亡无法采集血清导致的监测工作开展不了的空白，进一步完善了文山州动物疫病监测体系。

5.2 文山州禽流感监测方法首次从血清学拓展到病原学检测

血清学检测过程中会经常出现假阳性反应、降低检测的灵敏度、制备抗血清的时间较长且利用该方法一次只能检测一种病毒。病原学检测具有特异性高、灵敏度高、快速准确的优点，通常一次可以检测多种病毒。文山州高致病性禽流感PCR检测方法的建立和应用，监测方法由血清学转变为病原学，确保了疫情的准确快速监测。

6 效益分析

6.1 经济效益

（1）建立快速、敏感的高致病性禽流感病PCR检测方法，降低监测成本，达到同类诊断生物制品的质量标准，监测成本降低50%。每年节约开支约20万元左右。

（2）揭示高致病性禽流感病在文山州的传染源及分布规律，建立实时、动态、有效的高致病性禽流感病监测预警，由于防控及时，降低了高致病性禽流感疫情发生概率。大大减少疫情发生而造成的经济损失，以及扑灭疫情所投入的大量人力、财力、物力等支出，以文山州首次出现了4例人感染H7N9亚型流感病例为例，2017年6月，文山州因发生H7N9亚型流感疫情导致扑杀阳性及同群禽32903羽，按现行价50元/只计算，养殖户损失1645150元（32903×50），因市场关闭、禁止活禽移动，导致165.95万羽活禽推迟上市1个月（2017年文山州出栏禽1991.44万羽，平均月出栏165.95万羽），按每天每羽禽平均增加饲养成本0.2元计算，养殖户损失995.7万元，以上两项共计让养殖户损失1160.22万元。

（3）由于常规养殖风险会产生一定的畜禽死亡率，按降低死亡率2%计算，每年可减少家禽死亡28.01万羽，减少经济损失1400.50万元。（按2017年家禽存栏统计数1404.4万羽，以现行价50元/羽计算）。

以上3项合计共2580.7万元。