多组分免疫亲和柱净化/超高效液相色谱-串联质谱检测水产饲料中的黄曲霉毒素

刘文静，余海霞，严忠雍，张小军*，丁国芳

(1.浙江海洋大学 食品与医药学院，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江大学 舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021)

黄曲霉毒素(AFs)由黄曲霉、寄生曲霉两类霉菌代谢产生，是一类结构相似且含多环不饱和香豆素的化合物[1]。目前已分离出17种AFs，其中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)常见于玉米[2-5]、水稻[4]、坚果[4]、香料[5]和牛奶[6]等各类食品和饲料[7]中。AFs对绝大多数养殖动物具有致死毒性、致畸性和致癌性，并对免疫和生殖系统具有损伤性[8]。研究表明，AFs普遍存在于水产饲料中，并在水产生物体内累积，显著破坏水产生物的健康和质量，从而对消费者的公共卫生健康产生潜在危害[9]。因此需要加强对水产饲料中AFs的检测和监控，以进一步提高水产品品质和保障消费者安全。

目前常用的AFs检测方法有薄层色谱法[10]、酶联免疫法[11-13]、荧光光度法[14-15]、高效液相色谱法[ 16-19]等。但上述方法的灵敏度相对较低，且易出现假阳性等问题，因此在应用方面受到限制。近年来，超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS/MS)[20-22]由于灵敏度高、定性准确而被广泛应用于饲料检测，但由于水产饲料基质复杂，亟需开发专一性强、净化效果好的前处理方法以获得更好的定性、定量效果。免疫亲和色谱柱净化是利用抗原和抗体特异性结合原理的一种新型高效的前处理方法，近年来在食品检测特别是单一目标物的前处理领域应用广泛[23]，但针对多组分净化的文献少见报道。本研究利用多组分免疫亲和柱净化建立特异性前处理方法，结合UPLC-MS/MS技术建立了水产饲料中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检测方法。该法灵敏度高、快速准确，适用于水产饲料中AFs的检测和监控。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

AFs混合标准品(纯度≥98.0%，美国Supelco公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(分析纯，美国Sigma公司)；氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为Milli-Q纯水器制备的超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm)。

AcquityTM超高效液相色谱仪、Quattro Premier XE串联四极杆质谱仪(美国Waters公司)；MS2旋涡混合器(德国IKA公司)；Centrifuge 5810高速离心机(德国Eppendorf公司)；电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；N-EVAP112氮吹仪(美国Organomation公司)；12通道固相萃取装置(美国Supelco公司)；AFs总量(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)免疫亲和柱(柱容量1 mL，北京华安麦科生物技术有限公司)；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；微孔滤膜(0.22 μm，津腾公司)。

1.2 实验方法

1.2.1溶液的配制AFs标准溶液：用 1 000 μL移液枪准确移取1.0 mL AFs标准品，以甲醇稀释并定容至4 mL，AFB1、AFG1的质量浓度为225 ng/mL,AFB2、AFG2的质量浓度为75 ng/mL，于4 ℃避光保存。将标准溶液分别以0.1%甲酸-乙腈(体积比4 ∶ 1)逐级稀释至所需浓度，制得中间液和使用液。

1.2.2样品提取准确称取(2±0.01) g粉碎样品(过1 mm分样筛)于50 mL离心管中，加入2.0 mL水后涡旋混合60 s。加入0.4 g氯化钠与10 mL 80%(体积分数)乙腈水，涡旋混匀，超声提取10 min,6 000 r/min 离心3 min。取上清液经滤纸过滤，取2 mL滤液于15 mL离心管中，加入8 mL水稀释，涡旋混合30 s，5 000 r/min离心3 min待净化。

1.2.3多组分免疫亲和柱净化免疫亲和柱恢复至室温后去掉亲和柱堵头，待柱内保存液排干后，将上述10 mL上样液以1～2 滴/s的流速过柱。上样结束后，用10 mL 24%(体积分数)乙腈水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，弃去全部流出液。用2 mL 1%甲酸甲醇溶液以1滴/s的流速洗脱，洗脱液收集于 15 mL离心管，于50 ℃水浴中氮气吹干，加入1.0 mL初始流动相溶解并涡旋混合30 s，过0.22 μm有机相滤膜后，待测。

1.2.4色谱条件Waters Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)；进样量为10.0 μL；样品室温度为10 ℃，柱温为40 ℃；流动相：A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；流速为0.25 mL/min。梯度洗脱程序：0～2 min，80%～20%A；2～3 min，40%～60%A；3～5 min，80%A。

1.2.5质谱条件电喷雾离子源，正离子扫描模式(ESI+)；多反应监测(MRM)方式检测；毛细管电压为3.0 kV；离子源温度为120 ℃；脱溶剂气温度为380 ℃，流速为550 L/h；锥孔气流速为50 L/h，锥孔气与脱溶剂气均为高纯氮气。4种AFs的MRM实验条件如表1所示。

*quantitative ion

图1 饲料样品加标的色谱图Fig.1 Chromatograms of feed sample fortified with standardsAFB1 and AFG1 spiked 1.5 μg/kg；AFB2 and AFG2 spiked 0.5 μg/kg

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1流动相的优化在ESI+模式下，流动相中加0.1%甲酸有利于化合物的离子化，并可改善色谱峰形。AFs易溶于乙腈，且具有较好的响应值，实验通过优化水相(0.1%甲酸)与有机相(乙腈)的比例，发现在“1.2.4”的洗脱梯度下能得到良好的色谱分离效果，出峰时间适中，峰形尖锐对称，且目标峰附近无明显杂峰。故选择0.1%甲酸-乙腈作为流动相，在该条件下饲料样品加标的色谱图见图1，其中AFB1、AFG1加标水平为1.5 μg/kg，AFB2、AFG2加标水平为0.5 μg/kg。

2.1.2质谱条件的优化AFs在ESI+模式下具有较高的响应强度，将AFs标准溶液(AFB1、AFG1质量浓度为225 ng/mL,AFB2、AFG2为75 ng/mL)以20 μL/min的流速注入离子源，对质谱参数进行优化。在一级质谱全扫描分析中，选择丰度最高的离子作为AFs的特征离子，调试优化出最佳锥孔电压和毛细管电压。经过二级碰撞诱导分析收集分析物的子离子信息，并对碰撞能量等质谱参数进行优化，选择响应最强的离子作为定量离子，响应次强的离子作为定性离子。最终确定4种AFs的质谱参数如“1.2.5”所示。

2.2 提取剂的选择

实验发现，饲料样品中先加入2 mL水浸润后再采用有机溶剂提取，能有效避免因饲料吸收提取液导致的提取不充分，可提高方法的回收率。由于高有机相比例的提取剂对饲料样品的效果最好，因此分别考察了70%甲醇水、80%乙腈水和纯乙腈作为提取剂时对4种AFs的提取效果。结果显示，采用70%甲醇水作为提取剂的提取率为28.5%～89%；纯乙腈作为提取剂的提取率为63%～82%；而采用80%乙腈水作为提取剂的效果最好，提取率为72.1%～95.4%。且采用80%乙腈水可使提取液分层明显，有利于后续实验操作，显著提高了实验效率，因此选择80%乙腈水为提取剂。

2.3 免疫亲和柱条件的优化

在多组分残留测定中，淋洗液和洗脱液会影响免疫亲和柱的效果，因此对淋洗液和洗脱液进行了优化。分别比较了纯甲醇、24%甲醇水、24%乙腈水的淋洗效果，发现24%乙腈水的淋洗效果最好，且4种AFs的净化效果随着淋洗体积的增大而逐渐提高，最终确定采用10 mL 24%乙腈水进行淋洗。

文献[14-16]多采用纯甲醇进行洗脱，本研究考察了纯甲醇、初始流动相、乙腈、1%氨水甲醇、1%乙酸甲醇、1%乙酸乙腈、0.2%甲酸甲醇、0.5%甲酸甲醇、1%甲酸甲醇的洗脱效果，将50 ng/mL的AFB1、AFG1以及15 ng/mL的AFB2、AFG2标准溶液直接上样，每1 mL洗脱液收集1次，共收集3 次。结果表明，对于上述9种洗脱液，第3 mL洗脱液中均基本未检出目标物，表明2 mL洗脱液即可将免疫亲和柱上的AFs完全洗脱，因此取2 mL洗脱液进行洗脱。相比之下，以1%乙酸甲醇、1%乙酸乙腈、1%甲酸甲醇洗脱的效果较好，4种AFs的回收率分别为84.8%～91.1%、99.1%～113%和97.7%～113%，由于在浓缩过程中1%甲酸甲醇更节约时间，故选择2 mL 1%甲酸甲醇作为洗脱液。

2.4 基质效应的影响

基质效应(Matrix effect，ME)是指基质中除分析物以外的其他成分对测定值的影响，是考察分析方法抗干扰能力的有效指标。实验在空白基质中分别添加一定量的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，采用本方法进行分析，计算空白基质中目标物响应值与纯溶剂中响应值的比值，得到本方法的ME值为93.6%～104.3%，表明不存在明显的基质效应影响。

2.5 线性关系与检出限

准确量取AFs标准溶液，配制AFB1、AFG1质量浓度为2.25、4.5、9.0、10.0、22.5 ng/mL(AFB2、AFG2质量浓度为0.75、1.5、3.0、6.0、7.5 ng/mL)的标准溶液，采用本方法进行测定，以定量离子的峰面积(y)对质量浓度(x)进行线性回归；以3倍信噪比(S/N=3)时的样品浓度为方法检出限(LOD)，以S/N=10时的样品浓度为方法定量下限(LOQ)。得到AFB1、AFG1和AFB2、AFG2分别在2.25～22.5 ng/mL和0.75～7.5 ng/mL范围内呈良好线性，相关系数(r)大于0.997；AFB1、AFG1的LOD和LOQ分别为0.3 μg/kg和0.7 μg/kg；AFB2、AFG2的LOD和LOQ分别为0.1 μg/kg和0.2 μg/kg(见表2)，本方法的LOQ低于文献报道值[24-29]。

表2 4种AFs的线性关系、检出限、定量下限、回收率及相对标准偏差Table 2 Linear relationships,detection limits,quantitation limits,recoveries and RSDs of four AFs

图2 AFB1和AFB2阳性样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of AFB1 and AFB2 positive sample

2.6 方法回收率与相对标准偏差

称取30份饲料样品，每份(2±0.01) g，均添加80 μL的4种AFs混合标准溶液(AFB1、AFG1的质量浓度为225 ng/mL；AFB2、AFG2的质量浓度为75 ng/mL)。按照本方法重复测定6次，持续测定5 d，并分别计算平均回收率、日内相对标准偏差(RSD)和日间RSD。结果显示，4种AFs的平均回收率为78.7%～85.5%，日内RSD为6.0%～6.5%，日间RSD为6.6%～7.0%(见表2)。

2.7 实际样品分析

采用建立的方法对市售鱼、虾等水产饲料各25个样品进行检测，其中5个样品检出AFB1，含量为0.320～1.813 μg/kg,1个香鱼饲料检出AFB2，含量为0.136 μg/kg。结果表明，目前水产饲料所含的AFs主要为AFB1和AFB2。另对本实验室常规存储的样品每2 d检测1次，发现AFB1和AFB2的含量均随着贮存时间的延长而增加，第10 d后上述50种样品均检出AFB1和AFB2，典型的阳性样品色谱图如图2所示。

3 结 论

本研究建立了水产饲料中4种AFs的免疫亲和柱净化/UPLC-MS/MS检测方法，在优化条件下方法的检出限为0.1～0.3 μg/kg，定量下限为0.2～0.7 μg/kg，平均回收率为78.7%～85.5%，日内RSD为6.0%～6.5%，日间RSD为6.6%～7.0%。对市售50种水产饲料进行了检测，检出6个阳性样品，主要为AFB1和AFB2，其含量为0.136～1.813 μg/kg。该方法特异性强、抗干扰能力好，且灵敏度和精密度较高，可广泛用于水产饲料等复杂基质中AFs的检测。