超分子溶剂分散液液微萃取/超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼血中13种硝基咪唑类药物残留

王 春，顾传坤，马 强，王长海*

(1.南京农业大学 资源与环境科学学院，江苏 南京 210095；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176)

硝基咪唑类药物(Nitroimidazoles,NMZs)是一类具有5-硝基取代咪唑杂环结构的化合物，因具有独特的抗菌抗原虫作用，被广泛用于杀灭及预防厌氧菌和病原虫。常见的硝基咪唑类药物主要有甲硝唑(MNZ)、二甲硝咪唑(DMZ)、异丙硝唑(IPZ)、洛硝哒唑(RNZ)等。硝基咪唑类药物具有潜在的致癌、致畸和致突变性，其代谢物因同样含有咪唑环而具有与原药类似的毒性，因此中国、欧盟、美国等国家和地区禁止在动物源性食品中使用此类药物[1-3]。然而，在畜牧、养殖等领域此类药物仍被违法使用，且可能残留在环境和生物体内。抗生素类药物在鱼体内的分布除鱼肉外，还存在于血液中[4]。选择鱼血作为检测对象，采用活体取血方法，可实现活体无损检测，且同一个样品可多次重复采样检测。目前，硝基咪唑类药物的检测方法主要有气相色谱法[5]、气相色谱-质谱法[6-8]、液相色谱法[9-12]、液相色谱-串联质谱法[13-17]、酶联免疫法[18]等。其中液相色谱-串联质谱法因兼具灵敏度高、特异性好的优势，是目前检测硝基咪唑类药物残留的常用方法。

样品前处理是整个分析过程的关键环节，直接影响分析方法的灵敏度和精密度。由于血液样品中含有大量的蛋白质、磷脂和内源性代谢物等基质，增加了液相色谱的分离负担，并可能引起基质效应，从而使检测结果出现偏差。因此需要开发适宜的样品前处理技术，以消除基质干扰，提高检测结果的准确性。目前，血样的常用前处理方法包括蛋白沉淀法[19]、液液萃取法[20- 21]、固相萃取法[22- 23]等。其中，蛋白沉淀法操作简单，但对分子量较小的蛋白质和大部分磷脂的去除效果较差；液液萃取法对蛋白质的净化效果较好，但有机溶剂对磷脂的共萃取效率很高，且操作繁琐、耗时；固相萃取法的净化效果较差，可能造成目标物和蛋白质或磷脂的共萃取效应，且操作复杂，成本高。

超分子溶剂是由两亲性化合物通过两相或分子间有序自组装过程形成的一种具有纳米结构的胶束聚集体[24]。超分子溶剂萃取是一种以超分子溶剂作为萃取剂的新型萃取技术，一般多使用反向胶束聚集成的萃取剂。由于反向胶束中心由亲水头基围成的水腔能阻碍蛋白质、淀粉、腐殖质等高分子进入萃取相，且水腔的大小可通过改变四氢呋喃比例来调整，因此超分子溶剂萃取还具有净化效果。该技术具有操作简单、成本低和溶剂用量少等优势，且适用于复杂基质中不同极性范围分析物的萃取，已被成功应用于食品、环境和生物等样品的前处理[25]。

本研究采用超分子溶剂分散液液微萃取技术对鱼血中的硝基咪唑类药物进行萃取，并对烷基醇种类与用量、四氢呋喃用量、涡旋时间和超分子溶剂用量等主要条件进行了优化，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了测定鱼血中13种硝基咪唑类药物残留的新方法。本方法简便快速、准确可靠，可用于鱼血中硝基咪唑类药物的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY超高效液相色谱仪、XEVO TQ三重四极杆质谱仪、MassLynx数据处理系统(美国Waters公司)；MS-H-Pro数显型磁力搅拌器(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；Milli-Q 超纯水器(美国Millipore公司)；AB204-S型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；CR 21N型高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；MS3型涡旋振荡器(德国IKA公司)。

甲醇、乙腈、四氢呋喃(色谱纯)购自美国Fisher公司；正戊醇(99%)、正己醇(98%)、正辛醇(99%)、正癸醇(98%)、正十一醇(98%)和正十二醇(99%)购自百灵威科技有限公司；正庚醇(98%)和正壬醇(99%)购自日本TCI 公司。2-甲硝咪唑、二甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、异丙硝唑、甲硝唑、特尼哒唑、赛克硝唑、羟基异丙硝唑、羟基甲硝唑、奥硝唑、替硝唑标准品购自美国Sigma公司；洛硝哒唑标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，所有标准品纯度均大于98%。13种硝基咪唑类化合物的基本信息见表1。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取13种硝基咪唑类药物标准品各10 mg(精确至0.1 mg)至10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备溶液。分别量取1 mL标准储备溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为20 mg/L的混合标准储备溶液。使用时以甲醇逐级稀释成系列质量浓度的标准工作溶液，现用现配。

表1 13种硝基咪唑类化合物的基本信息Table 1 Basic information of thirteen nitroimidazoles

1.3 超分子溶剂的制备

量取1.5 mL正辛醇和8 mL四氢呋喃迅速注入50 mL玻璃离心管中，加入30.5 mL超纯水，磁力搅拌5 min后，以3 000 r/min离心10 min，用注射器移取上层有机相于玻璃瓶中，4 ℃下密封保存。

1.4 样品前处理

采用尾静脉取血法对鱼样品进行取血，具体步骤为：用2 mL注射器从鱼侧线下方约1 cm处斜向上进针，直至针头触及鱼脊柱，轻轻转动针尖后略回拉针头。抽拉针管，保持针管处于吸气状态。采血完成后，立即移取0.1 mL血液样品，置于预先加入0.2 mL超分子溶剂的2 mL聚丙烯离心管中，涡旋振荡提取5 min，再以3 000 r/min离心10 min。移取0.05 mL上层液体过0.45 μm微孔滤膜，滤液置于0.3 mL微量进样瓶中，加入0.05 mL甲醇混匀，待测定。

1.5 分析条件

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流速：0.30 mL/min；流动相：A为水，B为乙腈；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。梯度洗脱程序：0.0～3.0 min，10%～ 60%B；3.0～3.5 min，60%～ 90%B；3.5～4.0 min，90%B；4.0～4.2 min，90%～ 10%B；4.2～5.5 min，10%B。

质谱条件：电喷雾离子源；正离子模式；毛细管电压：3.5 kV；射频透镜电压：0.5 V；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：800 L/h；锥孔气流量：50 L/h；碰撞气：氩气；碰撞气压力：0.32 Pa；数据采集模式：多反应监测(MRM)。13种硝基咪唑类化合物的质谱分析参数见表2。

表2 13种硝基咪唑类化合物的质谱分析参数Table 2 Mass spectrometric parameters of thirteen nitroimidazoles

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1烷基醇种类的选择超分子溶剂的萃取作用力主要体现在烷基链的疏水相互作用和亲水头基的氢键作用。本实验选择水、具有两亲性质的四氢呋喃分别与不同碳原子数的烷基醇(正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇)组成超分子溶剂，对13种硝基咪唑类药物进行萃取。如图1A所示，正辛醇/四氢呋喃/水组成的超分子溶剂对13种药物的萃取率为78.8%～116%，且比较稳定集中。其它烷基醇虽对部分药物的萃取效果较好，但萃取率波动较大。因此，选择正辛醇/四氢呋喃/水作为超分子溶剂。

2.1.2正辛醇用量的优化正辛醇/四氢呋喃/水组成的超分子溶剂属于反相胶束类型。保持超分子溶剂总体积为40 mL，四氢呋喃用量为8 mL，考察了正辛醇用量(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL)对13种药物萃取率的影响。结果显示，当正辛醇用量大于1.5 mL时，样品均可获得较好的萃取率。为节省有机溶剂，实验选择正辛醇的用量为1.5 mL。

2.1.3四氢呋喃用量的优化保持超分子溶剂总体积为40 mL，正辛醇用量为1.5 mL，考察了四氢呋喃用量(2、4、6、8、10、12 mL)对13种药物萃取率的影响。如图1B所示，当四氢呋喃用量为4～8 mL时，除羟基甲硝唑外，其余12种药物的萃取率较高且稳定。由于反相胶束类型的超分子溶剂体积与四氢呋喃用量呈指数关系[26]，即在固定正辛醇用量的条件下，增加四氢呋喃用量，所得到的超分子溶剂体积会增大，有助于获得更好的萃取效果。因此，综合考虑选择四氢呋喃的用量为8 mL。

2.1.4涡旋时间的优化在超分子溶剂分散液液微萃取过程中，分析物通过萃取剂和样品间的充分接触可迅速达到分配平衡，但血液样品的粘滞性会阻碍分散过程，降低萃取率，而通过涡旋可以促进超分子溶剂与血液样品中待测药物的充分混合，促进传质过程。实验考察了涡旋时间分别为1、3、5、7、9、11 min时样品的萃取率。结果显示，涡旋时间在1～3 min范围内时，回收率过高；5 min左右时，13种药物的回收率为82.9%～106%，整体较为理想；而超过5 min后，回收率出现下降。尤其是异丙硝唑和羟基甲硝唑的回收率降至80%以下。这可能是由于随着涡旋时间的增加，超分子溶剂萃取的待测药物重新被血液吸附，导致萃取剂中的目标物含量降低。因此，综合考虑选择涡旋时间为5 min。

2.1.5超分子溶剂用量的优化超分子溶剂与血液样品的体积比会影响萃取体系的黏度和分子扩散速度，进而影响萃取效率。考察了超分子溶剂与血液样品的体积比分别为1.5、2.0、2.5、3.0和3.5时样品的萃取率。结果显示，当体积比较小时，萃取体系的黏度较大，分子扩散速度低，导致萃取率偏低；随着体积比的增加，更多的目标物从血液中释放出来，导致萃取率增大并趋于稳定。但超分子溶剂用量过多时，血液中的内源性物质也会被释放，从而产生基质效应。因此，综合考虑选择超分子溶剂与血液样品的体积比为2.0。

2.2 色谱-质谱条件的优化

2.2.1流动相的选择考察了反相色谱常用的有机相溶剂(甲醇、乙腈和甲醇-乙腈(1 ∶ 1)混合溶剂)分别与中性、酸性和碱性水相(水，0.01%、0.05%和0.1%的甲酸溶液，0.01%、0.05%和0.1%的氨水溶液)组成的流动相体系对13种待测药物色谱行为的影响。结果表明，以乙腈-水为流动相时，目标物能获得较好的色谱峰形、分离效果和灵敏度。因此选择乙腈-水为流动相。

2.2.2流速的优化考察了流动相流速(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL/min)对13种待测药物色谱行为的影响。结果表明，低流速能够提高目标物的质谱响应强度，但同时会使色谱峰展宽、峰形变差；高流速虽会造成信号峰强度下降，但对峰形有改善作用。因此，综合考虑选择流动相流速为0.30 mL/min。

2.2.3色谱柱类型及温度的选择分别对规格均为2.1 mm×50 mm×1.7 μm的BEH C18、BEH RP18、BEH C8、BEH HILIC等具有不同选择性的色谱柱和色谱柱温度(30、35、40、45 ℃)进行考察。结果表明，BEH C18色谱柱在30 ℃下对13种待测药物的分离效果和信号响应强度最好。因此，最终选择BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)作为色谱柱，柱温为30 ℃。

2.2.4质谱条件的优化用蠕动泵分别将13种待测药物标准溶液(质量浓度均为1 μg/mL)以10 μL/min的流速注入电喷雾离子源，根据各药物的电离性质，选择在正离子模式下进行一级质谱分析，得到准分子离子[M+H]+信息。确定母离子后，再进行子离子扫描做二级质谱分析，选择丰度较大的两个碎片离子，其中以丰度最高的碎片离子作为定量离子，另一个作为辅助定性离子。分别对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等参数进行了优化。在最佳实验条件下，13种硝基咪唑类药物的多反应监测色谱图见图2。

2.3 方法学考察

2.3.1线性范围、检出限及定量下限在优化实验条件下，测定一系列不同质量浓度的混合标准溶液，以峰面积(y)对其质量浓度(x)进行线性回归，绘制标准工作曲线。结果表明，13种硝基咪唑类药物在各自范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)大于0.998。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到13种待测药物的LOD为0.05～0.2 μg/L，LOQ为0.1～0.5 μg/L(见表3)。

2.3.2回收率与相对标准偏差以不含待测物的血液样品为空白基质，分别添加低、中、高3个水平的混合标准溶液，按照本方法进行测定，每个水平平行6次，计算加标回收率。结果表明，13种硝基咪唑类药物的平均回收率为88.4%～105%，相对标准偏差(RSD)为4.3%～11%(见表3)，可满足实际检测需求。

2.3.3基质效应评估由于血液基质复杂，蛋白质、磷脂和内源性代谢物等成分与目标组分在雾滴表面离子化过程中可能会产生竞争，使目标离子的生成效率及离子强度增强或抑制，进而影响测定结果的精密度和准确度。采用提取后加入法计算绝对基质效应，公式为：基质效应(ME)=(提取空白基质所得溶液中添加相同含量化合物的响应值/纯溶剂中化合物的响应值)×100%。结果表明，13种待测药物的基质效应为86.1%～101%。可见采用超分子溶剂作为萃取剂，可以有效提取目标物质，很好地消除血液样品基质效应的干扰。

表3 13种硝基咪唑类药物的线性范围、相关系数(r2)、检出限、定量下限、回收率及相对标准偏差Table 3 Linear ranges,correlation coefficients (r2),limits of detection(LOD),limits of quantitation(LOQ),recoveries and relative standard deviations(RSD) of thirteen nitroimidazoles

2.4 与其他方法的比较

本方法与文献方法[7,13,27]的比较见表4。与传统的液液萃取法和固相萃取法相比，本方法的有机溶剂用量明显减少，降低了对环境和操作人员的危害；且检测灵敏度与文献方法相当或有所提高。总体上，本方法操作简单，萃取与净化一步完成，避免了实验误差与样品损失，适用于血液等复杂基质中硝基咪唑类药物的分析。

表4 与其他文献报道的硝基咪唑类药物检测方法的比较Table 4 Comparison with other published methods for the determination of nitroimidazoles

2.5 实际样品检测

采用本方法对本地区市售的鲤鱼、草鱼、鲫鱼和罗非鱼共10个样品进行了检测，其中1个鲤鱼样品检出二甲硝咪唑，质量浓度为1.76 μg/L，其余样品均未检出待测药物。

3 结 论

本研究建立了超分子溶剂分散液液微萃取结合超高效液相色谱-串联质谱测定鱼血中13种硝基咪唑类药物残留的分析方法，并对烷基醇的种类与用量、四氢呋喃用量、涡旋时间和超分子溶剂用量等因素进行了考察。在最佳条件下，13种待测药物的检出限为0.05～0.2 μg/L，定量下限为0.1～0.5 μg/L；在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为88.4%～105%，RSD为4.3%～11%。该方法无需复杂的样品前处理，具有准确高效、环境友好的优点，可满足动物源性食品质量监测的需求。