磁性纳米标记检测技术在生物医学即时检测领域的研究进展

康静茹，杨 欣，张德军，胡 军，杨 海*

(1.华中科技大学 生命科学与技术学院 国家纳米药物工程技术研究中心,湖北 武汉 430074；2.湖南省汉寿县科技和工业信息化局，湖南 常德 415900；3.武汉纳达康生物科技有限公司，湖北 武汉 430074)

即时检测技术(Point of care testing，POCT)又被称为床旁诊断，能够提供快速的诊断结果，有助于更快的临床决策，同时也能减少对大型检验设备的依赖[1]。随着大健康和个体化诊疗观念的逐步深入，POCT已成为生物医学领域中备受关注的研发热点。

以胶体金、荧光量子点、上转换荧光纳米粒等为代表的光学标记检测技术是目前POCT研究的主流方向。然而基于光学标记的检测方法大多存在信号强度偏低、生物样品背景干扰复杂等问题，许多方法只能实现定性或半定量检测。与光学标记检测相比，磁标记检测技术具有独特优势。首先，磁性纳米粒(Magnetic nanoparticles，MNPs)具有独特的超顺磁性和磁响应性，可通过磁分离将待测物从体系中纯化富集，显著提高检测灵敏度。其次，磁信号强度高、穿透性好。光学标记检测多用于表层信号检测，而磁标记信号在生物组织中衰减极小，可以检测生物样品内几乎所有深度的信号，避免了信号丢失，进一步提高了检测灵敏度。此外，由于生物组织中的大部分成分无磁性，MNPs的磁信号不会受到背景干扰，因而磁信号的对比度强、信噪比高，对样品前处理的要求低，适用于痕量分析和复杂基质样品的分析。同时，通过磁传感器、弛豫分析以及磁感应等多种技术可以方便地将磁信号转化为电信号，实现宽线性范围定量检测。目前已有多种检测技术及商业化仪器成功用于磁性标记定量检测，其检测原理已在本研究小组发表的综述文章中详细阐述[2](表1)。这些磁性检测装置大多具有结构简单、检测成本低等优点，很好地满足了POCT检测的要求。

由于磁性检测的独特优势，以磁性纳米粒作为标记物的定量检测技术在疾病诊断、食品安全检测、动物疫病防治等众多领域发挥着越来越重要的作用。在生物医学领域，磁标记检测技术已经广泛用于检测蛋白质、核酸、细胞以及病原体等对象，可以为多种疾病提供宽线性范围的高灵敏、特异性诊断。本文将根据检测对象的不同，总结阐述磁性纳米粒近几年来在POCT领域的最新研究进展。

表1 几种常见的磁标记检测方法及适用对象Table 1 Several common magnetic nanoparticles labeling detection technologies and their applicable objects

1 蛋白质检测

蛋白质是疾病诊断中最常见的一类生物标志物，可以揭示某些疾病发展的状况，是目前POCT中研究较多的一个方向。蛋白质标志物主要包括特异性抗体、病原相关抗原、激素和酶等几类。磁标记检测技术检测蛋白质最常用的方法是免疫测定法，即通过功能化的MNPs与待测物发生抗原-抗体反应，特异性地检测目标蛋白质的含量。

肿瘤标志物的早期筛查可以为肿瘤的诊断与治疗提供重要的参考价值，但对检测技术的特异性和灵敏度提出了较高的要求。磁标记检测技术具有灵敏度高的特点，目前已成功地应用于多种肿瘤标记物的检测。王侃等[20]利用MAR读数计，将超顺磁性纳米粒作为标记物的侧流免疫分析(Lateral flow immunoassay，LFIA)技术首次用于血清中胃癌标志物CA72-4的定量检测,其将超顺磁性MNPs(SPMNPs)标记上CA72-4的特异性抗体Ab1，并将另一个捕获抗体Ab2和二抗分别包覆在硝酸纤维素膜上，形成检测线(T线)和控制线(C线)。当血清样品中含有分析物时，在T、C线位置上会发生免疫结合反应，过程如图1A所示。通过MAR读数计读取试纸条上T线和C线的信号，即可实现对分析物的定量检测，如图1B所示。该方法可以在20 min内检出低至0.38 IU/mL的CA72-4，线性范围宽达0～100 IU/mL。该方法在对临床样品的分析中达到了很好的灵敏度与特异性，且与电化学免疫法(ECLIA)的一致性较好，有望在胃癌的早期诊断和治疗中发挥作用。

前列腺抗原(PSA)是前列腺癌的标志物，体内含量超过4 ng/mL即代表异常，因此需要高灵敏度的方法来进行检测。磁性纳米标记物能够有效地提高检测的灵敏度，从而满足PSA的检测要求。Luxton等在LFIA中使用顺磁性纳米粒子测量血清样品中的总PSA，通过共振线圈磁力计(RCM)读取磁信号，检测限达0.8 ng/mL[11]。Rivas等采用扫描磁诱导传感器读取磁信号，将PSA的检测限降低至0.2 ng/mL[21]。磁性纳米标记技术也被用于其它癌症标记物的检测，如白细胞介素-6[22]、甲胎蛋白[23]、癌胚抗原CEA[24]等。

磁标记检测技术对炎症蛋白的检测也是一个研究热点。C反应蛋白(C reactive protein，CRP)是一种急性期炎症蛋白，高水平CRP多见于细菌感染和炎症，低水平的CRP多见于病毒感染。传统的金标免疫层析用于CRP检测时灵敏度和线性范围难以达到要求，因此需要开发线性范围较宽、灵敏度较高的检测方法。Magnia®Reader读数计采用MNPs作为标记物，可以定量地检测磁信号，实现对CRP高灵敏度、宽线性范围的检测。LifeAssays公司的VetReader读数计也采用类似的原理，主要用于动物的急性期蛋白检测。

心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)是急性心肌梗死诊断的一种特异性心脏标志物。对于急性疾病而言，需要快速诊断以免延误病情，而传统的中央临床实验室的检测方法需要很长的检测时间。此外，cTnⅠ的检测还要求具有足够高的灵敏度。Xu等[25]采用磁性标记LFIA的方法实现了对cTnⅠ的高灵敏度快速检测。结果显示，该方法检测限达0.01 ng/mL，检测时间小于15 min，与ELISA方法相比具有更高的灵敏度和更宽的检测范围。

激素类生物标志物的检测也能提供很多生理诊断信息，如人绒毛膜促性腺激素(HCG)的检测可以用于妊娠诊断。基于胶体金的免疫层析最早即用于HCG检测，该技术的发展促使了市面上早孕试纸的出现。但金标免疫层析只能提供定性或半定量的检测结果，磁性标记免疫层析方法则可以实现高灵敏度的定量检测，有助于区分正常妊娠和异常时的病理情况。Vuento等在LFIA 中使用MNPs作为标记物对人尿液中的HCG进行定量检测，检测限为20 U/L，检测只需10 min[26]。Serrate等用磁阻传感器检测HCG，检测限达5.5 ng/mL，可在1 min内检出结果[27]。

2 核酸检测

核酸具有很高的特异性，在病原菌的检测、癌症的早期诊断以及个人的基因分型等方面可以发挥重要作用。尤其是对于癌症、冠心病和传染性疾病等，基因分析有望实现早期诊断以及治疗方案的优化。但在临床分析上，核酸样本量通常较少，需要先将核酸从复杂的生物基质中提取出来，再进行样本量的扩增以及信号的放大[28]。而磁性纳米粒可与磁富集和磁分离相结合，能够在核酸的捕捉、分离和操纵中发挥作用，有望将多个步骤整合到一个微流控装置中。

DNA杂交具有高特异性，能导致MNPs磁阻或磁化率的改变，进而可通过磁阻传感器或磁化率计等装置进行检测，故利用磁性纳米粒子和DNA杂交可以探测DNA序列。Xu等采用巨磁阻(GMR)传感器检测人乳头瘤病毒(HPV)质粒扩增的DNA，实现了对HPV的基因分型，达到了约90%的准确度，可以根据分型结果对HPV感染进行诊断，并评估样本发展为癌症的可能性[3]。Cui等将GMR传感器、磁性纳米粒聚合物、PCR技术和线性探针杂交等多种技术结合起来，对质粒模板扩增后的HPV DNA进行了B型和C型的分型，检测限低至200 IU/mL，可在15 min内得出分型结果[29]。

此外，Johansson等还利用交流磁化率计检测滚环扩增后的DNA与MNPs的结合反应，检测限几乎与商业ELISA系统处于相同的灵敏度范围内[14]。Sepehri等将高温超导量子干涉仪(H-Tc SQUID)与微流体结合，测量MNPs与滚环扩增后的DNA 分子结合后交流磁化率的改变，用以检测霍乱弧菌DNA分子，检测限约为0.2×10-18mol[30]。

检测循环游离DNA(cfDNA)的量是一种应用于癌症诊断的非侵入式方案。血液中的cfDNA主要由细胞凋亡或坏死产生，细胞的凋亡和坏死分别对应cfDNA中短链DNA和长链DNA的释放。传统的方法是检测cfDNA中由肿瘤细胞产生的循环肿瘤DNA(ctDNA)的量，然而ctDNA在cfDNA中的比例小于1%，这对检测方法的灵敏度提出了很高的要求。Dias等通过GMR传感器检测cfDNA中长链DNA片段(ALU115)和短链DNA片段(ALU247)的比值，并作为癌症诊断的依据，检测限达到pmol/L的范围[31]。

对miRNA的检测有助于理解其在基因调控中的作用，了解它们在癌症诊断中作为肿瘤标记物的表达情况。由于miRNA序列很短，表达水平多样化，因此很难同时实现高灵敏度、单碱基特异性、宽动态范围以及良好再现性的检测。Wang等采用一种交换诱导剩余磁化的方法来检测miRNA[32]，其检测限达到了10-21mol的范围，且不需要扩增和洗涤程序。Lu等也是基于磁弛豫的方法检测miRNA，不同的是他们在一步反应中采用了磁性微球(1 μm，MM1000)-DNA-磁性纳米粒(30 nm，MN30)的偶联物和双链特异性核酸酶(DSN)[33]。DNA探针与MM1000和MN30形成三明治夹心结构，当存在靶miRNA分子时，靶miRNA与互补DNA探针杂交，形成DNA-RNA异源双链。该杂合双链会被DSN特异性地裂解开，导致MN30的释放，使得T2时间增加，其原理如图2所示。该方法可以检测到尿液中低至5 fmol/L的miR-21，并在100个癌细胞中实现了对miR-21表达水平的定量检测，能够区分miR-21在肿瘤和正常组织中的表达情况。

图2 采用磁微粒(1 μm，MM1000)-DNA探针-磁性纳米粒(30 nm，MN30)复合物一步法检测miRNA的原理图[33]Fig.2 Schematic of microRNA(miRNA) detection in one step using magnetic microparticle(1 μm，MM1000)-DNA probe-magnetic nanoparticle(30 nm，MN30) conjugates(MM1000-DNA-MN30)[33]

图3 通过微霍尔传感器检测稀有细胞的原理实现图[6]Fig.3 Design and implementation of the micro-Hall(μHall) detector used to rare cells[6]

3 细胞检测

对稀有细胞(如循环肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞和干细胞等)的定量检测和分子表达的分析有可能用于检测和监控癌症等疾病。传统的细胞检测技术，如质谱分析、荧光显微镜等，需要复杂的样品前处理和纯化过程。此外，稀有细胞检测在临床应用上还面临着细胞浓度低、尺寸小等挑战。Weissleder等采用微霍尔传感器，直接在全血中检测免疫磁珠标记的单个靶细胞，不需要洗涤和纯化过程，其检测原理如图3所示[6]。霍尔传感器可以采用更大的外加磁场来磁化MNPs，提高检测灵敏度，同时具有高的带宽，能实现每分钟107个细胞的高效筛查。采用不同磁珠还可以同时对一个细胞内的多种生物标志物进行检测。

磁弛豫技术也可以直接检测出癌细胞，实现癌症的早期诊断。Hathaway等基于MNPs与乳腺癌细胞内抗Her2抗体的偶联，通过超导量子干涉仪(SQUID)测量磁弛豫从而检测出移植到小鼠中的活乳腺癌细胞的数目[34]。Tan等设计出了基于适体共轭磁性纳米粒的磁弛豫开关(MRSw)，利用适体与靶癌细胞结合的特异性，在复杂的生物基质以及细胞混合物中检测出特定的癌细胞，其检测限达250 μL样品中10个癌细胞[35]。

此外，Flynn等利用SQUID传感器和MNPs检测移植器官中的T淋巴细胞[36]。可以检测出移植器官中105个T细胞，而免疫系统攻击的早期产生的小结节中产生数以百万计(106数量级)的T细胞，相比之下，该方法具有较高的灵敏度，一定程度上可以取代活体组织切片检验，为移植排斥反应提供早期预警并对免疫抑制化疗方法进行监测。

4 病原体检测

病原体(Pathogen)是能引起人体疾病的微生物和寄生虫的统称，包括病毒、细菌、真菌、蠕虫和媒介生物等。传统的病原体检测方法大多过程复杂、耗时长。即时检测技术可以提供快速准确的检测结果，尽快明确治疗方案，有效控制疾病的蔓延。由于病原体的抗原以及核酸具有特异性，因此病原体的检测多通过检测病原体的蛋白质或核酸来实现。下文主要介绍MNPs对3类常见病原体——细菌、病毒以及寄生虫的检测。

4.1 细菌检测

细菌感染是很多疾病的起因，因此对细菌的检测至关重要。病原菌检测的金标准是细菌培养，但该方法耗时长，一般需要数周的时间才能得到结果。对于某些传染病而言，在这期间可能会出现疾病的大规模蔓延以及病菌的变异等问题，因此发展快速灵敏的检测方法对于病原菌的检测以及传染病的治疗很有必要。

POCT中通常利用细菌抗体与细菌结合的特异性，通过免疫层析的方法来检测细菌。Zhang等[37]采用炭疽杆菌抗体偶联的超顺磁性MNPs作为LFIA的标记物，在土壤和牛奶等复杂基质中特异性地检测出炭疽杆菌孢子。Xiang等建立了一种免疫磁性分离与LFIA联用的检测系统，可准确快速地检测出单增李斯特菌，检测限达104CFU/mL，比常规LFIA低至少一个对数值[38]。

通过检测核酸也可以检测细菌。细菌核糖体DNA的16S、23S和16～23S rDNA序列在种内均高度保守，通过设计相关的DNA片段探针可以检测出病原菌。Weissleder等利用小型化NMR设备结合特异于16S rRNA的磁-DNA探针用于细菌的16S rRNA[39]检测。该方法能够在2 h内同时对临床样品中的13种细菌进行检测，灵敏度达单个细菌。该课题组的Liong等也在一个便携式NMR装置中，实现了对提取后的DNA的扩增、收集、磁标记以及检测，可以从结核患者的唾液中检测出结核分枝杆菌并识别出抗药性菌株，整个过程可在2.5 h内完成[40]。Hansen等采用集成了蓝光读数单元的小型化低成本设备，通过检测磁标记的布朗弛豫的改变，对滚环扩增后的大肠杆菌DNA进行定量检测，其检测限低至10 pmol/L[41]。基于磁弛豫原理的T2Dx仪器目前已经走向商业化。Lowery等利用T2MR诊断平台，直接在全血中对5种念珠菌属进行检测，不需样品纯化，且检测时间缩短至3 h内，有效地避免了疾病的恶化[42]。此外，Petti等还利用MTJ(磁隧道结)传感器装置检测单增李斯特菌的DNA，检测限达nmol/L范围，并可一次检测多种病原菌[43]。

4.2 病毒检测

就病毒性疾病以及传染病而言，对致病病毒进行快速、准确的即时检测，从而对初诊患者进行确诊，是阻止疾病进一步恶化和蔓延的重要办法。临床上病毒的即时检测通常通过检测病毒核酸或抗原来实现。

基因检测技术具有很高的灵敏度和特异性，可用于病毒的基因分型[29,44]。此外，直接检测血清中的抗原也是病毒检测中的常用方法。Granade等将MICT磁性免疫分析系统用于磁性侧向流层析中，实现了对HIV-1 p24抗原的检测[45]。HIV-1 p24抗原比HIV抗体早7～10 d出现在血液中，但浓度更低。金标免疫层析受到灵敏度的限制，仅能检测出HIV抗体，而磁性免疫分析具有更高的灵敏度，可以检测到HIV-1 p24抗原，从而可更早地诊断出艾滋病，减少感染早期的传播。Peck等利用MICT平台对人乳头瘤病毒(HPV)的HPV E6癌蛋白进行检测，其检测限比传统的ELISA方法低[46]。Wang等还设计了一种基于GMR传感器的手持式仪器，通过检测核蛋白的方法来检测甲型流感病毒[47]。

图4 病毒诱导的磁性纳米粒自组装示意图[48]Fig.4 Diagram of viral-induced nanoassembly of magnetic nanoparticles[48]

此外，磁弛豫的方法也为病毒检测提供了新的思路。Perez等发现，在特定病毒颗粒存在下，与病毒表面特异性抗体缀合的单分散磁性纳米颗粒会自组装形成具有增强磁性的超分子结构，该过程发生的磁弛豫变化可以用NMR检测到，其原理如图4所示[48]。该方法可在复杂生物介质中特异性地检测病毒，能够在每10 μL中5个病毒颗粒的浓度下检测腺病毒-5和单纯疱疹病毒-1，而不需要通过PCR对样品进行大量扩增。Jiang等通过磁弛豫开关一步检测了细菌和病毒，且将目标富集、提取和检测集成到一个步骤中，整个免疫测定在30 min内即可完成[49]。

4.3 寄生虫检测

寄生虫病的爆发具有高度的流行性和传染性，并且所流行的地区大多医疗资源有限。检测寄生虫病的金标准方法包括显微观察和血清学鉴定等，但检测通常需要在特定的场合才能进行，并且存在灵敏度不高，容易漏检等问题。POCT检测不需要昂贵的设备和专业的人员，有助于确认感染源和寄生虫的携带者，更有效地控制疾病的蔓延。Handali等建立了用于检测绦虫病和脑囊虫病的MICT平台，利用重组蛋白(rES33和rT24H)定量地检测出阶段特异性抗体，是一种快速有效的寄生虫病的诊断方法[50]。

5 其他检测

其他一些小分子物质也是医学检验中的重要生化指标。非共轭雌三醇(uE3)是在胎儿生长发育过程中起重要作用的雌激素之一，容易在血清中降解，因此需要快速检测。Wang等在LFIA中采用竞争法原理检测uE3，该方法的检测限为0.86 nmol/L，检测时间短至15 min[44]。Oliveira等采用便携式的GMR传感器定量检测出内皮细胞的细胞微泡，该方法简单快速、特异性好，可以为某些疾病的诊断提供参考信息[51]。

此外，多元检测将是磁性免疫层析技术未来的发展方向。在同一条试纸条上检测多种物质，一方面可以提高检测效率和降低成本。另一方面，对于某些有联检意义的指标，可能有很大的医学应用价值。Wang等通过在一个试纸条上固定两种抗体，同时显示出两条T线，从而可以同时检测小细胞肺癌的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)两种物质，有效地提高了早期诊断的准确性[52]。Gaster等还同时对多种生物体液中多种肿瘤标志物进行了检测[53]。Nikitin等通过将不同特异性的几个LFIA条带连接到一个微型圆筒墨盒中，利用MPQ读数计，同时对A、B和E型肉毒毒素(BoNT)进行了检测[17]。

6 总结与展望

磁性纳米标记物具有独特的超顺磁性和磁响应性，在生物医学检测领域得到了日益广泛的应用[54-55]。与光学标记检测相比，磁标记检测在生物样本中的背景干扰小、信噪比高、磁信号穿透性强，且信号易于检测。这些优点使得磁标记检测技术具有更高的检测灵敏度，而且对大多数生物样品可直接检测，前处理要求低。磁标记检测的特性使得其在生物分析物的定量分析、痕量分析以及复杂基质样品的分析等领域具有显著的优势。目前，磁标记检测技术已成功地用于蛋白质、核酸、细胞以及病原体等多种物质的高灵敏度定量检测。

磁标记检测技术在医学诊断领域具有广阔的应用前景：其高灵敏度的特性，使之可用于对某些低浓度的疾病标志物进行检测，为疾病的诊断和治疗提供新的思路；磁标记检测仪器小型化和便携化的特点也很好地满足了即时检测的要求，使得对疾病的诊断和监测可以在患者身边进行；磁标记物与POCT技术、磁分离等技术的结合，通常能够比传统的生化实验室检验方法更快地得到检测结果，可以实现某些急性疾病和传染性疾病的快速诊断，从而有效地避免疾病恶化，遏制疾病蔓延。

目前磁标记检测技术还有很大的发展空间。例如，在MNPs的制备方法、抗体的偶联方法以及磁信号的读取方法等方面还可以进一步优化；将具有信号放大作用的链霉素-亲和素系统等集成到抗原-抗体的结合系统中，也能够进一步提高检测的灵敏度；此外，新的疾病标志物的发现有希望将磁标记检测技术拓展到更多疾病的诊断中。随着科技的不断发展，磁标记检测技术的灵敏度将会进一步提高，同时对多种物质进行检测将是今后发展的一个大方向，检测仪器将会变得更加小型化和便携化，并在更多疾病的即时诊断中得到应用。