稳定同位素稀释-UPLC-MS/MS法测定饲料中4种黄曲霉毒素

■孟繁磊 宋志峰 谭 莉 魏春雁

（吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，吉林长春 130033）

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一组真菌毒素代谢物，主要有4种天然存在的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。黄曲霉毒素对人类和动物都是有毒和致癌的，黄曲霉毒素B1和G1比黄曲霉毒素B2和G2毒性更大[1-2]。由于这种毒性，政府规定严格限制其在食物中的含量，因此，就需要灵敏、精确、可重复的方法来检测这些毒素。这些方法主要有基于配有荧光检测器的反相高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法。然而，因为反相洗脱液会淬灭黄曲霉毒素B1和G1的荧光效应，通常需要衍生以增强这些分析物的反应，主要有三氟乙酸进行柱前衍生[3]以及使用碘法[4]、电化学衍生溴法[5]、光化学UV衍生法进行柱后衍生[6-7]等，但这些方法存在前处理过程繁琐或需要配备单独的衍生系统等缺点。近年来，质谱技术的发展提高了选择性和灵敏度，并提供了区分目标物与共提取物的能力，液相色谱串联质谱也广泛应用于黄曲霉毒素的检测[8-10]。但饲料样品基质复杂，常常存在较大的基质效应干扰，通过基质配标的方法可以校正，但一些基质特别复杂的样品基质效应很难校正。将稳定同位素稀释方法配合液相色谱串联质谱法应用于饲料中黄曲霉毒素的检测可以消除基质效应的影响，同时还可以消除前处理过程中的损失，使检测结果更准确可靠。因此，本文建立了饲料中4种黄曲霉毒素的稳定同位素稀释-超高液相色谱串联质谱的检测方法，优化了前处理条件和仪器工作条件，以使方法能够满足饲料中黄曲霉毒素的检测要求。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

乙腈和甲醇（色谱级），赛默飞世尔科技公司；黄曲霉毒素B1（5 μg/ml）、黄曲霉毒素B2（5 μg/ml）、黄曲霉毒素 G1（5 μg/ml）、黄曲霉毒素 G2（5 μg/ml）、13C17-AFTB1（0.5 μg/ml）、13C17-AFTB2（0.5 μg/ml）、13C17-AFTG1（0.5 μg/ml）、13C17-AFTG2（0.5 μg/ml），均购自美国Sigma公司；超纯水用Millipore纯水机制备。

1.2 仪器与设备

QTRAP 5500三重四级杆线性离子阱复合质谱仪（AB Sciex公司）；LC-30AD超高效液相色谱仪（岛津公司）；KQ-500DE数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；X3R离心机（Thermo公司）；VG3 S025涡旋混匀器（德国IKA公司）；MyCOsepTM226多功能净化柱[ROMER国际贸易(北京)有限公司]。

1.3 准溶液配制

1.3.1 混合标准工作液（100 ng/ml）

分别取质量浓度均为5 μg/ml的黄曲霉毒素B1（AFTB1）、黄曲霉毒素B2（AFTB2）、黄曲霉毒素G1（AFTG1）、黄曲霉毒素G2（AFTG2）各200 μl于10 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，-20℃下密封避光保存。

1.3.2 混合同位素内标工作液(50 ng/ml)

准确移取 0.5 μg/ml13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-AFTG1、13C17-AFTG2各1 ml于10 ml容量瓶，用乙腈定容至刻度，-20℃下密封避光保存。

1.3.3 标准系列工作溶液

用50%的甲醇水溶液将混合标准工作液(100 ng/ml)配成 AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2质量浓度均为0.2、1、5、10、50、250 μg/l的标准混合溶液，使用时分别取此混合标准溶液450 μl与50 μl的混合同位素内标工作液(50 ng/ml)混匀即得标准系列工作溶液。

1.4 样品前处理

准确称取5 g饲料样品（精确到0.01 g）于50 ml离心管中，加入250 μl同位素内标工作液混合后静置30 min，加入20 ml乙腈-水（84∶16，v/v），漩涡混匀，超声波提取30 min，5 000 r/min离心10 min，收集上清液经MyCOsepTM226多功能净化柱净化，取4 ml净化液于50℃下氮气吹干，用1 ml初始流动相溶解残留物，漩涡混匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤于进样瓶中，UPLC-MS/MS检测。

1.5 UPLC-MS/MS仪器条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱:Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流动相：A相为5 mmol/l甲酸铵溶液，B相为甲醇；梯度洗脱程序如下：0～1 min，36%B；3～4 min，50%B；4.2～5.5 min，100%B；5.6～8 min，36%B；流速：0.3 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：3 μl。

1.5.2 质谱条件

离子源：ESI；电离模式：正模式；监测方式：多反应监测MRM；离子化电压：5 500 V；气帘气30 psi；雾化温度：550 ℃；雾化气：55 psi；辅助气：55 psi。其它质谱采集参数见表1。

表1 4种黄曲霉毒素及其同位素内标的质谱条件

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

黄曲霉毒素常用的提取溶液为乙腈-水（84∶16，v/v）[11-12]和甲醇-水（70∶30，v/v）[13-14],本文以10 μg/kg的添加水平来考察两种提取溶剂的提取效果，以4种黄曲霉毒素的回收率为考察指标，结果见图1。结果表明，用乙腈-水（84∶16，v/v）提取的回收率的略高，此外，乙腈-水（84∶16，v/v）为提取剂，对饲料中蛋白质沉淀效果也较为明显，所以，本文选择乙腈-水（84∶16，v/v）为提取溶剂。

2.2 质谱条件的选择

将4种黄曲霉毒素及其同位素内标用50%的甲醇配成50 μg/l的单标，通过针泵直接进样，测定其在ESI+和ESI-的质谱信号强度，结果发现4种黄曲霉毒素及其同位素内标在ESI+模式下，可以得到丰度值较高的[M+H]+准分子离子峰，确定[M+H]+为其母离子；然后优化去簇电压DP，保证母离子的传输；接着采用子离子扫描，选择2个响应值较强的子离子（同位素内标只选择1个响应最强的子离子用于定量），最后对碰撞能量CE进行优化。质谱条件的选择结果见表1。

图1 提取溶剂的选择

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线和线性范围

将1.3.3标准系列工作溶液按照1.5的条件依次进样检测，以各黄曲霉毒素的浓度为横坐标x（μg/l），以各毒素峰面积与对应毒素内标的峰面积比为纵坐标y，绘制标准曲线，其回归方程、相关系数（r2），线性范围见表2。结果表明，4种黄曲霉毒素在0.18～225 μg/l范围内，线性关系良好，相关系数均大于0.999 0。

2.3.2 方法的检出限和定量限

用空白饲料样品为基质，以标准曲线最低点浓度的添加量加入混合标准溶液后按照1.4处理后测定，以信噪比（S/N）为3，确定方法的检出限，以信噪比（S/N）为10，确定方法的定量限，结果见表2。结果表明，在本方法的检测条件下，AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2的检出限分别为 0.015、0.025、0.015、0.025 μg/kg，定量限分别0.05、0.1、0.05、0.1 μg/kg，满足检测的要求。

2.3.3 加标回收率和重复性

向空白的饲料样品中加入黄曲霉毒素混合标准溶液，以回收率试验来考察本方法正确度，同时以回收率测试结果的相对标准偏差（RSD）考察方法的重复性。分别添加定量限、10倍定量限、限量值附近三个水平浓度，每个添加浓度平行测定6次，具体的添加浓度、回收率和RSD结果见表3。结果显示，4种黄曲霉毒素的平均回收率在76.19%～102.29%之间，符合《GB 27417—2017合格评定化学分析方法确定和验证指南》的要求，表明该方法用于提取测定饲料中4种黄曲霉毒素准确可行；4种黄曲霉毒素平均回收率的RSD在1.91%～10.12%之间，表明该方法重复性良好。

表2 4种黄曲毒素的回归方程、线性范围、检出限、定量限

表3 4种黄曲霉毒素的添加回收率（n=6）

3 结论

本文建立了稳定同位素稀释-UPLC-MS/MS技术测定饲料中4种黄曲霉毒素的方法。样品经乙腈-水（84∶16，v/v）溶液超声波提取后，采用MyCOsepTM226多功能净化柱净化后，用UPLC-MS/MS进行检测。提取前加入稳定同位素一方面消除了基质效应的影响，另一方面对前处理过程中的损失也给予了校正。本方法具有前处理操作简单快速、结果准确等优点，结果满足国家标准的要求，适用于饲料中4种黄曲霉毒素的定量分析，也可为其他基质中4种黄曲霉毒素含量的检测提供参考依据。