基于抗氧化活性的复合酶法提取香菇菌糠多糖的工艺优化

■林 杉 冮 洁谭皎敏 韦 胜 刘 洁 马海龙

（大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 116600）

香菇（Lentinus edodes）别称花菇，为真菌门侧耳科[1]。香菇多糖是香菇菌丝体中最重要的生物活性物质，具有抗氧化[2-4]、抗衰老、抗炎、保肝护肝和降血糖等作用[5-7]。菌糠是食用菌收获后的培养基剩余物，我国年产各类菌糠总量约为900万吨，大部分被作为废物遗弃。菌糠具有较高的营养价值，是一类优质的非常规饲料原料[8]。菌糠饲料的合理开发与利用既能减少环境污染，又能缓解我国饲料资源紧缺现状。菌糠饲料在猪[9]、羊[10]、兔[11]、鸡[12]和牛[13]等养殖中都有应用。香菇菌糠中残留大量香菇菌丝体，富含蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素及多糖等生物活性物质，与子实体具有相似的生物活性和功能[14-15]。香菇作为大量栽培的食用菌，其菌糠量非常大，但由于香菇菌糠中粗木屑比例高，直接做饲料难以咀嚼和消化，而利用其菌糠提取多糖再应用在饲料中，不仅可在产业循环经济中提高附加值，延伸产业链，还可以减少菌糠的废弃，减少污染，实现经济和生态效益的双赢[16-17]。

香菇菌糠多糖的提取方法大多采用传统的热水浸提法[18]。近年来，为改善其提取方法，国内对香菇多糖的提取工艺进行了深入的研究，主要有酸碱提取法、超声辅助提取、微波辅助提取、复合酶辅助提取以及多种方法的联用，使提取工艺得到了优化，并研究了影响得率的因素[19]。但基于抗氧化活性的复合酶法提取香菇菌糠多糖的工艺未见报道。本文研究了香菇菌糠多糖的复合酶法提取工艺及其抗氧化活性，为其进一步开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇菌糠，大连宝野农业发展有限公司提供；木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶，江苏锐阳生物技术有限公司；苯酚、浓硫酸、无水乙醇、柠檬酸、无水乙酸钠、Tris-HCl溶液、硫酸亚铁铵溶液、邻二氮菲、过氧化氢、邻苯三酚、盐酸、均为分析纯或化学纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PL203电子精密天平：梅特勒-托利多仪器(上海）有限公司；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HH-S水浴锅：巩义市英峪予华仪器厂；UV-2800紫外分光光度计：龙尼柯(上海)仪器有限公司；中药粉碎机：宁波新芝有限公司；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；循环水式真空泵：巩义市华仪器有限责任公司；移液枪：赛默飞世尔仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 香菇菌糠多糖的提取

挑选干燥的香菇菌糠，放入粉碎机中进行粉碎，精确称取5.0 g粉碎后的香菇菌糠，按照料液比1∶30（mg/ml)加入150 ml的去离子水，按照设定的酶解条件（pH值、酶解温度、酶解时间、酶浓度）进行复合酶解实验，复合酶比例为木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶=1∶1∶1，然后在85℃的水浴锅中浸提100 min，得到多糖浸提液，多糖浸提液经过滤得到多糖上清液，测定多糖含量。

1.3.2 多糖含量的测定

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[20]。

多糖提取率（%）=提取出的粗多糖中纯多糖量/香菇菌糠原料量×100

1.3.3 多糖提取单因素实验

准确称取粉碎样品5.0 g，置于三角瓶中，按照料液比1∶30（mg/ml)，加入150 ml的去离子水，将复合酶[21-22]的条件定为纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的比例为1∶1∶1，分别考察不同酶解时间（10、20、30、40、50 min）、不同pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、不同酶解温度（25、35、45、55、65 ℃）和不同酶浓度（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）对香菇菌糠多糖提取率的影响。

1.3.4 香菇菌糠多糖的抗氧化活性

1.3.4.1 清除羟自由基（·OH）活性实验

取10支10 ml刻度管，均依次加入1 ml的 Tris-HCl溶液(pH值为8.2，0.05 mol/l)，0.3 ml硫酸亚铁铵(5 mmol/l)和 0.3 ml的邻二氮菲溶液(7.5 mmol/l)，1号和2号试管不加样品，3到6号加入1 ml浓度分别0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，7号到10号加入浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的VC溶液，1号试管不加入H2O2（7.5 mmol/l），2到10号试管加入H2O2。定容至刻度。在37℃的水浴锅中反应1 h，用Tris-HCl溶液调零，在510 nm下测吸光度A，计算对·OH的清除率。VC做阳性对照，将实验重复3次，求平均值。

·OH清除率(%)=(A3-A2)/(A1-A2)×100

式中：A1——体系不加H2O2和多糖(抗氧化剂)的吸光值；

A2——体系加H2O2而不加多糖（抗氧化剂）的吸光值；

A3——体系加入H2O2和多糖(抗氧化剂)的吸光值。

1.3.4.2 抑制超氧阴离子（O2-·）活性实验

取9支10 ml刻度管，各加入0.05 mol/l Tris-HCl缓冲液4.5 ml，置于25℃水浴中预热25 min，1号到4号分别加入0.1 ml浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，5号到8号分别加入浓度为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的VC溶液及0.4 ml邻苯三酚溶液（0.5 mmol/l），混匀后于25℃水浴中反应4 min，加入HCl（8 mol/l）2滴终止反应。以Tris-HCl缓冲液调零，于320 nm处测定吸光度，空白对照组以相同体积的蒸馏水代替。VC做阳性对照。将实验重复3次，求平均值。

O2-·清除率（%）=（Ao-Ai）÷Ao×100

式中：Ao——体系未加多糖溶液(抗氧化剂)的吸光值；

Ai——体系加入多糖溶液(抗氧化剂)的吸光值。

1.3.4.3 清除DPPH·效果的测定

取9支试管，1号为空白试管，加入2 ml无水乙醇和2 ml DPPH溶液。2号到5号试管分别加入2 ml浓度为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，四个试管都加入2 ml的DPPH，反应0.5 h后在517 nm处测吸光值Ai。6号到9号试管分别加入2 ml浓度为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/ml的香菇菌糠多糖溶液，四个试管都加入2 ml的无水乙醇，反应0.5 h后在517 nm处测吸光值Aj。VC做阳性对照。将实验重复3次，求平均值。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）]/Ac×100

式中：Ai——体系加入DPPH和多糖溶液（抗氧化剂）的吸光值；

Aj——体系加入多糖溶液而未加DPPH的吸光值;

Ac——体系不加入多糖溶液的吸光值。

IC50值指清除率为50%时所需样品的浓度。

2 结果与讨论

2.1 酶作用时间对香茹菌糠多糖提取率的影响（见图1）

图1 酶作用时间对香菇菌糠多糖提取率的影响

由图1可知，当酶作用时间为50 min时，酶与底物得到充分反应，此时香茹菌糠多糖的提取率最高，为9.00%。当提取时间大于30 min后，香茹菌糠多糖提取率增加趋于平缓，酶解时间过长，酶的催化活性下降，进而对香茹菌糠多糖提取率影响不大，最佳酶解时间选定为50 min。

2.2 酶作用pH值对香茹菌糠多糖提取率的影响（见图2）

图2 pH值对香菇菌糠多糖提取率的影响

由图2可知，pH值对酶的活性会产生影响，从而影响香茹菌糠多糖的提取率。当pH值为3.5时,香菇菌糠多糖的提取率最低，溶液的酸度过大抑制了酶的活性；当pH值为5.0时，香菇菌糠多糖提取率达到9.10%，之后，随着pH值增大，香茹菌糠多糖的提取率反而减小，这是因为pH值的升高影响了酶与底物的亲和力，破坏了酶的活性，从而造成了香茹菌糠多糖提取率的下降。因此，pH值为5.0时最佳。

2.3 酶作用温度对香茹菌糠多糖提取率的影响（见图3）

图3 酶作用温度对香菇菌糠多糖提取率的影响

由图3可知，在45℃之前，随温度的升高，香茹菌糠多糖提取率不断增加，在45℃时提取率达到最大，为9.45%。然后从45℃到65℃随温度升高，提取率缓慢下降，可能是由于温度过高，使酶的活性降低，从而影响香菇菌糠多糖的提取率。因此，选择复合酶作用45℃为最佳。

2.4 酶浓度对香菇菌糠多糖提取率的影响(见图4)

图4 酶浓度对香菇菌糠多糖提取率的影响

由图4可知，当酶浓度增加到3%时，香茹菌糠多糖提取率最高约为9.50%，说明在该底物浓度下，酶浓度已经趋于饱和，细胞内多糖已溶出，若继续添加复合酶，对香茹菌糠多糖的提取率没有显著的影响。因此，酶浓度初步选为3%。

经过单因素优化获得复合酶法辅助提取香菇菌糠多糖适宜条件为：酶解时间50 min，pH值5.0，酶解温度45℃，酶浓度3%。经过验证试验，在此提取条件下香菇菌糠多糖的提取率为9.6%。而采用传统的热水浸提法提取香菇菌糠多糖，提取率为6.28%，复合酶法比其提取率提高了52.70%。

2.5 香菇菌糠多糖抗氧化性研究

2.5.1 香菇菌糠多糖对羟自由基（·OH）的清除作用（见图5）

图5 香菇菌糠多糖对羟自由基（·OH）的清除作用

由图5可知，香菇菌糠多糖对羟自由基均具有一定的清除作用。当香菇菌糠多糖浓度在0.1～0.7 mg/ml时，清除率趋于稳定的上升。当质量浓度为0.7 mg/ml时，VC对羟基自由基清除率达到79.07%，而香菇菌糠多糖对羟基自由基清除率为59.58%。因此，香菇菌糠多糖与VC相比清除能力较弱。香菇菌糠多糖清除·OH的半数抑制浓度IC50为0.58 mg/ml，VC的IC50为0.34 mg/ml。

2.5.2 香菇菌糠多糖对超氧阴离子(O2-·)的清除作用（见图6）

图6 香菇菌糠多糖对超氧阴离子的清除作用

由图6可知，加入香菇菌糠多糖的体系对邻苯三酚自氧化所产生的超氧阴离子自由基具有较明显的清除作用。当香菇菌糠多糖浓度在0.1～0.7 mg/ml之间时，香菇菌糠多糖对超氧阴离子自由基的清除率增加较快。当质量浓度为0.7 mg/ml时，VC对邻苯三酚自氧化反应中所产生的超氧阴离子自由基清除率达到79.30%，而香菇菌糠多糖对超氧阴离子自由基清除率为56.80%。香菇菌糠多糖清除(O2-·)的半数抑制浓度 IC50为 0.60 mg/ml，VC 的IC50为 0.37 mg/ml。

2.5.3 香菇菌糠多糖对DPPH自由基的清除作用（见图7）

图7 香菇菌糠多糖对DPPH自由基的清除作用

在DPPH自由基清除实验中，反应时间、光照强度、pH值等因素会对实验结果有一些影响，造成粗多糖在不同实验条件下有不同的抗氧化活性。若条件允许，未来可用高效液相色谱法、化学发光法等效率高且准确的实验方法研究香菇菌糠多糖对抗氧化剂DPPH自由基清除的效果[23-24]。

由图7可知，随着质量浓度的增加，香菇菌糠多糖溶液和VC对DPPH自由基清除率不断增大，香菇菌糠多糖质量浓度0.7 mg/ml时，样品溶液多糖对DPPH自由基清除率达到41.3%，具有较强清除DPPH自由基的能力，而VC在质量浓度为0.7 mg/ml，对DPPH自由基清除率达到了77.4%，清除DPPH自由基的能力强于香菇菌糠多糖。香菇菌糠多糖清除50%DPPH自由基的半数抑制浓度IC50为0.90 mg/ml，VC的IC50为 0.39 mg/ml。

3 结论

本文通过使用复合酶解法辅助提取香菇菌糠多糖，得到香菇菌糠多糖的最佳提取工艺为酶解时间50 min，pH值5.0，酶解温度45℃，酶浓度3%。在此提取条件下香菇菌糠多糖的提取率为9.60%。提取效果显著优于传统的热水浸提法，提取率提高了52.70%。水浸提法是传统的提取方法，提取率相对较低，而酶解法具有条件温和、易去除杂质，操作简单又能保证较高的提取率。因此，用酶解法辅助提取香菇菌糠多糖是高效科学的，并且适用于实际生产中。

香菇菌糠多糖对羟自由基（·OH）、超氧阴离子(O2-·)和DPPH自由基具有较好的清除作用，并与质量浓度呈正相关关系。香菇菌糠多糖清除·OH的IC50为0.58 mg/ml，清除 O2-·的 IC50为0.60 mg/ml、清除 DPPH自由基的IC50为0.90 mg/ml。证明了香菇菌糠多糖具有很好的抗氧化作用。