高碳水化合物水平膨化饲料对大规格草鱼糖代谢相关指标的影响

■ 吴桐强 胡 毅 * 钟 蕾 陈 团 ，3 陈云飞 ，3 曹晓莉 戴振炎

（1.湖南农业大学湖南省特色水产资源利用工程技术研究中心，湖南长沙 410128；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000；3.通威股份有限公司，四川成都 610041）

碳水化合物是为生命体提供热能的三种主要营养素中最廉价的营养素。在鱼体内，碳水化合物作为能量消耗的利用较蛋白质和脂肪低。而相对于蛋白质和脂肪，碳水化合物则容易获得，且能显著降低饲料成本。但是，摄入高碳水化合物通常会导致鱼体出现肝肿大、肝糖原累积、生长性能下降[1]，并且认为，鱼类耐糖机能低下的原因是胰岛素量分泌不足导致的[2]。然而也有大量的研究认为参与鱼类糖类代谢的酶也是其中的主要影响因素。在大菱鲆上的研究得出，GK在高糖情况下(添加量为28%)活性呈下降趋势，PK也出现了类似的情况[3]。对翘嘴红鲌的研究表明，摄食高碳水化合物饲料可提高GK的活性及基因的表达[4]。草鱼因易饲养、草食性、生长快、群体产量高，近年来已成为淡水养殖的当家品种之一。与肉食性和杂食性鱼类相比，草食性鱼类对糖的利用较高。研究发现，草鱼能够利用饲料中37%～56%的碳水化合物水平，对其生长没有显著影响[5]。然而，在本试验的前期研究中，当饲料碳水化合物水平高于37%后，草鱼增重率下降，同时，肝体比和肝糖原含量升高，显著影响了草鱼的生长性能[6]。鉴于此，本试验以小麦和小麦麸为碳水化合物源，研究了高碳水化合物水平（CHO＞37%）对大规格草鱼糖代谢相关的激素和酶的影响，为探索高糖水平下，大规格草鱼生长性能下降提供合理的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲料配制

以小麦和小麦麸为主要糖源，玉米蛋白粉、进口DDGS、豆粕和菜粕为蛋白源，保持每种饲料蛋白源在总蛋白源中比例一致，试验共设置7个处理组，设置蛋白质水平为30%、28%、26%、24%、22%、20%、18%，碳水化合物（无氮浸出物）水平依次为31%、34%、37%、40%、43%、46%、49%，配制成7种全价配合膨化饲料，分别为P30C31(C1组)、P28C34(C2组)、P26C37(C3组)、P24C40(C4组)、P22C43(C5组)、P20C46(C6组)、P18C49(C7组)。试验饲料由通威股份有限公司南昌分公司提供，饲料原料使用利达超微粉碎机粉碎，粉碎细度达到80%，过80目筛，通过牧羊混合机，混合均匀度为5.2%，最后通过恒润145双螺杆膨化机膨化，制作粒径为4.0的膨化饲料，试验饲料配方及营养水平如表1。

表1 试验饲料组成及营养水平

1.2 饲养管理

试验在湖南省娄底市新化县车田江水库网箱进行。试验鱼种购于湖南省岳阳市湘阴县某苗种场，鱼种暂养于5 m×4 m×5 m的网箱中。试验网箱采用聚乙烯网箱，大小为2 m×2 m×2 m。试验开始时挑选规格均匀、体格健康的草鱼分两轮进行分箱，试验共7个处理，每个处理设置三个平行，共21个网箱，每个网箱放草鱼30尾，鱼初始体重为(398.6±5.9)g。试验期间水温为（26.1±2.12）℃。温度低于25℃时以草鱼体重的1%～2%投喂，日投喂两次（8：30～10：00、15：30～17：00），早晚比例为40%、60%；水温高25℃时以草鱼体重的3%投喂，日投喂三次（7:00～8：00、11：00～12:00、17：00～18：00），早中晚比例为20%、35%、45%。投喂方法为人工手撒，每次分多批投喂。每天记录天气、水温、草鱼的摄食以及死亡情况。试验周期为16周。

1.3 样品采集

试验结束后，饥饿24 h，从每个网箱随机抽取6尾草鱼，用丁香油麻醉（1∶10 000）后从尾静脉取血，装于1.5 ml离心管中4℃静置过夜，然后3 000 r/min离心10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，用于血清胰岛素和胰高血糖素的测定；根据前期研究结果，高碳水化合物水平饲料会导致鱼体肝体比、脏体比、肠体比以及肌肉和肝脏脂肪含量升高（胡毅，2018）[6]，因此选择正常碳水化合物水平C1（CHO 31%）、C2（CHO 34%）、C3（CHO 37%）组和高碳水化合物水平C7（CHO 49%）组，解剖腹腔，取出完整的内脏，分离出肝脏，保存于-80℃冰箱，用于测定肝脏糖代谢酶活性。

1.4 指标测定

1.4.1 血清胰岛素和胰高血糖素的测定

血清胰岛素和胰高血糖素含量均采用上海研辉生物科技公司生产的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行测定。

1.4.2 肝脏酶活性测定

称取一定重量的肝脏，用PBS溶液清洗肝脏组织，然后将肝脏组织放入10 ml的匀浆管中，按1∶9的比例加入9倍体积的PBS（pH值7.4），用匀浆器将组织匀浆充分。3 000 r/min 4℃离心20 min，收集上清液用于草鱼肝脏糖代谢相关酶的测定。己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）、葡萄糖激酶（GK）、磷酸果糖激酶（PFK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、1,6-二磷酸果糖酶（FBPase）和葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的测定均采用上海研辉生物科技公司生产的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行测定。

1.5 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan's法多重比较组间差异性，当P＜0.05时表示差异显著，数据表示为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 日粮中不同碳水化合物和蛋白水平膨化饲料对大规格草鱼糖代谢激素的影响（见图1）

图1 不同碳水化合物水平饲料对大规格草鱼血清胰岛素和胰高血糖素的影响

由图1可知，投喂不同碳水化合物日粮16周后，与正常C1～C3(31%～37%CHO)组相比，高碳水化合物C4～C7(40%～49%CHO)组草鱼血清胰岛素、胰高血糖素含量呈升高趋势，其中C4组胰岛素含量显著高于C3组(P＜0.05)，C4和C7组胰高血糖素含量显著高于正常组(P＜0.05)。

2.2 日粮中不同碳水化合物和蛋白水平膨化饲料对大规格草鱼肝脏糖酵解指标的影响(见图2)

由图2可知，各饲料组碳水化合物水平对PFK、PK活性无显著性影响（P＞0.05）。与正常C3(37%CHO)组相比，高碳水化合物C7(49%CHO)组GK活性显著降低(P＜0.05)。与正常C1、C3(31%、37%CHO)组相比，高碳水化合物C7(49%CHO)组HK活性显著降低(P＜0.05)。

2.3 日粮中不同碳水化合物和蛋白水平膨化饲料对大规格草鱼肝脏糖异生指标的影响（见图3）

图2 不同碳水化合物水平饲料对大规格草鱼GK、HK、PFK和PK活性的影响

图3 饲料中不同糖源及水平对大草鱼中肝脏中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和1,6-二磷酸果糖酶(FBPase)、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的影响

由图3可知，各饲料组碳水化合物水平对PEPCK无显著影响（P＞0.05）。在正常C1～C3(31%～37%CHO)组，FBPase的活性呈升高趋势，且C3组显著高于C1组（P＜0.05）。而在高碳水化合物C7(49%CHO)组，FBPase的活性则呈降低趋势。在正常C3(37%CHO)组中，G-6-Pase活性呈上升的趋势，而继续升高碳水化合物水平C7(49%CHO)组对G-6-Pase活性无显著影响（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 高碳水化合物水平膨化饲料对大规格草鱼糖代谢激素的影响

胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。在哺乳动物中，胰岛素是主要的合成代谢激素刺激餐后葡萄糖被外周组织如肝、骨骼肌和脂肪组织吸收。在鱼类上面，则差异较大。在欧洲海鲈(Dicentrarchus labrax)[7]和异育银鲫(Caras⁃sius auratus gibelio bloch)[8]中的研究发现，摄食高碳水化合物饲料，能够显著提高鱼血清中的胰岛素水平。这与本试验研究结果基本一致，结果表明，大草鱼饲料中较高的碳水化合物水平促进了胰岛素的分泌。然而，在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[9]上面的研究则得出摄食高糖饲料对分泌胰岛素的β细胞并无影响，高碳水化合物并不能显著促进胰岛素的分泌。目前，膳食碳水化合物水平对胰岛素释放的影响存在着争议。胰岛素的释放受内源性或外源性物质如葡萄糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激。在本研究中，血浆胰岛素水平和血糖似乎是不相关的，试验前期研究显示，在喂食含碳水化合物8周后的大草鱼后，血液中的葡萄糖无显著差异[6]。因此，本试验的胰岛素并未受到血糖的调节作用，而可能是胰高血糖素的分泌促进了胰岛素的释放，亦或者类似于精氨酸类的营养物质更能够对胰岛素的分泌起到促进作用[10]。鱼类胰高血糖素同样受到饲料营养物质的调节。一般认为，鱼类摄入葡萄糖后，会抑制胰高血糖素的分泌。在本试验中，胰高血糖素与胰岛素有着同样的趋势，高碳水化合物水平促进了胰高血糖素的分泌。说明胰高血糖素并未受到血糖的调节。其原因可能与哺乳动物类似，血浆中的氨基酸水平更能够促进鱼类胰高血糖素水平[11]。

3.2 高碳水化合物水平膨化饲料对大规格草鱼肝脏中糖代谢相关酶活性的影响

在糖代谢机理中，糖酵解起分解糖的作用，而糖异生则扮演糖合成的角色,两者相互作用，才能起到维持血糖内稳态。调节鱼类糖酵解的关键酶为己糖激酶(HK)、葡萄糖激酶(GK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK),调节糖异生的关键酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、1,6-二磷酸果糖酶(FBPase)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)。

鱼体对碳水化合物利用低的原因,被认为是鱼类GK缺乏或活性很低[12]。近来的研究表明鱼类肝脏中存在GK，日粮中碳水化合物能诱导翘嘴红鲌(Culter⁃alburnus Basilewsky)[13]、吉富罗非 鱼(GIFT Oreochro⁃mis niloticus)[14]、瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli）[15]、南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[16]、青鱼（Mylopharyn⁃godn piceus）和鲫（C.anratus）[17]的GK表达量，且高碳水化合物饲料显著增加了肝脏GK的表达量。本研究发现，当大草鱼膨化饲料中碳水化合物水平为37%时，大草鱼能够诱导GK活性的提高。而当饲料碳水化合物水平从37%增加至49%时，GK活性则显著下降。在大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[3]中也有类似的研究结果。推测可能是膨化饲料更易于鱼体对碳水化合物的消化吸收，而使得大规格草鱼对碳水化合物的需求更低，因此过高的碳水化合物则抑制了GK的表达。有研究表明，HK非常保守,不受营养状况和饲料碳水化合物的诱导[3，13，16]。在本研究中大草鱼肝脏HK活性随着膨化饲料中碳水化合物水平的升高呈先下降后上升的趋势，说明膨化饲料中碳水化合物能够诱导大草鱼肝脏中HK活性的变化。但是碳水化合物水平达到37%以后，升高碳水化合物水平HK则显著下降。因此，可认为是大规格草鱼对高糖饲料的一种负反馈调节。在大黄鱼（Larimichthys crocea）[18]的研究中也得出了类似的结果，在高糖水平下，HK的活性降至最低点。在大草鱼试验中，PK和PFK活性不受饲料糖含量的诱导，这分别与大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[3]和南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[16]等中的研究结果一致。

有研究指出，鱼类摄食高碳水化合物饲料后FBPase活性无显著变化[19]。本试验大规格草鱼肝脏FBPase活性随着膨化饲料中碳水化合物水平的升高不断上升，但碳水化合物水平升至49%时，FBPase的活性则呈下降趋势。说明膨化饲料中高碳水化合物水平抑制了FBPase的活性。这与在团头鲂(Megalo⁃brama amblycephala)[20]上的研究结果相似。一般认为，高碳水化合物水平能够抑制葡萄糖异生，然而鱼类肝脏中G-6-Pase的活性却能随饲料碳水化合物的增加而增强[21]。但是在鲤鱼（Cyprinus carpio）[22]和大黄鱼（Larimichthys crocea）[18]中的研究表明，G-6-Pase活性与日粮碳水化合物水平之间存在负相关。本试验中，随着碳水化合物水平升高，G-6-Pase活性呈升高的趋势，而C7组G-6-Pase活性与C3组无显著差异，但是有上升的趋势。说明G-6-Pase能够随着碳水化合物水平的升高而升高，但是高糖下，大规格草鱼能够调控G-6-Pase活性的异常升高。FBPase是调节糖异生的关键酶，G-6-Pase是糖异生的第一个限速酶，膨化饲料中高碳水化合物水平抑制了FBPase的活性且G-6-Pase活性并无显著升高，说明大规格草鱼体内的糖异生调节机制比较完善。PEPCK是肝和肾中糖元异生的关键酶[23]。研究认为，低碳水化合物的饲料更能显著提高PEPCK的活性[24]。在瓦氏黄颡鱼[15]（Pelteobagrus vachelli）的研究中也得出了类似的结论，PEPCK的相对表达量，随着饲料糖含量的增加呈下降趋势。然而本实验中，饲料中碳水化合物水平的增加对大草鱼肝脏PEPCK无显著影响。出现这种差异的原因可能跟鱼的种类亦或者不同的糖源有关，具体的机制还需进一步研究探讨。

4 结论

综合考虑膨化饲料中碳水化合物水平对大规格草鱼胰岛素、胰高血糖素、糖代谢酶的影响，认为大规格草鱼饲料中碳水化合物的适宜水平为37%，过高的碳水化合物水平会对肝脏糖酵解存在一定程度的抑制，不利于大规格草鱼机体对于碳水化合物的调节。因此长期摄食高糖水平的膨化饲料可能会影响大规格草鱼正常的生理功能。