天麻素在L6肌管中促进葡萄糖消耗的作用和机制研究

张勇 孔维佳

[摘要] 目的 研究天麻素（GSTD）在L6肌管中促進葡萄糖消耗的作用和可能机制。 方法 体外培养大鼠L6骨骼肌细胞并诱导分化成肌管，血清饥饿后以GSTD单独处理或与浓度为0.05 nmol/L的胰岛素联合处理24 h，以二甲双胍（Met）为阳性对照药。部分实验中L6肌管先以浓度为100 nmol/L的胰岛素处理24 h以诱导胰岛素抵抗，再进行药物处理。以试剂盒测定细胞糖消耗、L-乳酸释放和ATP产生，以Western blot和实时荧光定量反转录PCR检测目标蛋白和基因的表达水平。 结果 GSTD浓度依赖性地促进L6肌管的基础糖消耗[与对照细胞比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）]，并且显著增加胰岛素刺激的糖消耗[与单用胰岛素或GSTD处理的细胞比较，差异有统计学意义（P < 0.05）]。在胰岛素抵抗状态下，浓度为500 μmol/L的GSTD仍能有效促进细胞糖消耗（P < 0.05）。Met处理后显著增加细胞的L-乳酸释放并抑制ATP产生[与对照细胞比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）]，但GSTD没有作用。GSTD显著上调L6肌管GLUT4蛋白和mRNA的表达，并且激活AMPK和Akt通路，表现为处理后p-AMPKα和p-Akt的水平显著增加[与对照细胞比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）]。 结论 GSTD作用于L6肌管显著增加其糖消耗并能克服胰岛素抵抗，其机制可能与GLUT4的上调以及AMPK和Akt通路的激活有关。

[关键词] 天麻素;葡萄糖消耗;胰岛素抵抗;糖酵解;葡萄糖转运蛋白4;AMP依赖的蛋白激酶

[中图分类号] R587.1;R284.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（a）-0022-04

[Abstract] Objective To investigate the activities and possible mechanisms of gastrodin （GSTD） to promote glucose consumption in L6 myotubes. Methods Rat L6 skeletal muscle cells were cultured in vitro and differentiated into myotubes. After serum starvation， GSTD was used to treat the myotubes for 24 h， either alone or in combination with insulin at a concentration of 0.05 nmol/L. Metformin （Met） was used a positive control drug. In some experiments， L6 myotubes were treated with 100 nmol/L of insulin for 24 h to induce insulin resistance before drug treatment. Commercial kits were used to determine cell glucose consumption， L-lactate release， and ATP production. The expression levels of target proteins and genes were determined by Western blot and real-time quantitative reverse transcription-PCR （RT-PCR）. Results GSTD promoted the basal glucose consumption of L6 myotubes in a concentration-dependent manner [comparing with control cells， the diferences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）]. In addition， GSTD greatly increased the insulin-stimulated glucose consumption [comparing with cells treated with insulin or GSTD alone， the diferences were statistically significant （P < 0.05）]. In a state of insulin resistance， GSTD at a concentration of 500 μmol/L was still effective to promote cell glucose consumption （P < 0.05）. After treatment， Met significantly increased cellular L-lactate release but decreased ATP production [comparing with control cells， the diferences were highly statistically significant （P < 0.01）]. However， GSTD did not have such effects. GSTD greatly up-regulated the protein and mRNA expression levels of GLUT4 in L6 myotubes. In addition， it activated the AMPK and Akt pathways， as indicated by the significant increase of p-AMPKα and p-Akt levels after treatment [comparing with control cells， the diferences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）]. Conclusion When used to treat L6 myotubes， GSTD greatly increases glucose consumption and is able to overcome insulin resistance. The mechanisms may be associated with the up-regulation of GLUT4 as well as the activation of AMPK and Akt pathways.

[Key words] Gastrodin; Glucose consumption; Insulin resistance; Glycolysis; Glucose transporter 4; AMP-activated protein kinase

天麻素（GSTD）是兰科植物天麻的主要有效成分之一，具有多种药理作用。有研究发现GSTD在链脲佐菌素（STZ）诱导的小鼠糖尿病模型中能有效降低空腹血糖[1]。笔者实验室的研究也发现，GSTD用于治疗KK-Ay糖尿病小鼠能显著降低空腹血糖，改善葡萄糖耐量并增加胰岛素敏感性[2]。但目前GSTD在细胞水平对葡萄糖代谢的具体作用尚不明确，因此本文在体外培养的大鼠L6骨骼肌细胞中研究其对葡萄糖代谢的影响和机制。

1 材料與方法

1.1 药物与试剂

GSTD购自浙江诚意药业股份有限公司（批号：20150812，纯度≥98%）;二甲双胍（Met）（PHR1084）和人胰岛素溶液（I9278）购自美国Sigma公司;DMEM培养基（11965092）和胎牛血清（FBS）（10100147）购自美国Gibco-Invitrogen公司。葡萄糖检测试剂盒（己糖激酶法）（GL1611）购自英国Randox公司;L-乳酸测定试剂盒（E0139084）购自北京九强生物技术股份有限公司;ATP含量测定试剂盒（A095）购自南京建成生物工程研究所。葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）（#2213）、AMP依赖的蛋白激酶α（AMPKα）（#5832）、p-AMPKα（Thr172）（#2531）、Akt（#4691）、p-Akt（Ser473）（#4058）和β-肌动蛋白（ACTB）（#4970）的鼠源或兔源单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。细胞RNA提取（LS1040）、定量（E3310）、反转录（A3500）和实时荧光定量PCR（A6001）试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和处理  大鼠L6骨骼肌细胞以DMEM培养基+10% FBS，于37℃、5%CO2的环境进行培养，细胞传代后生长至70%～80%融合时按文献[3-4]报道诱导分化直至出现肌管。L6肌管在无血清DMEM培养基中饥饿12 h然后进行相应处理，时间为24 h，所有处理组均设4个复孔。

1.2.2 糖消耗测定  L6细胞以5×104/孔的密度接种于96孔板，诱导分化并处理后收集培养液，以500 g离心5 min（半径13.5 cm），收集上清液以试剂盒测定其中葡萄糖浓度并按照文献[3-4]报道的方法计算细胞糖消耗。对于胰岛素抵抗状态下的糖消耗实验，L6肌管先以浓度为100 nmol/L的胰岛素处理24 h以诱导胰岛素抵抗[5]，再做相应处理后测定细胞糖消耗，胰岛素敏感的L6肌管同时处理作为对照。

1.2.3 L-乳酸和ATP测定  L6细胞以2×105/孔的密度接种于12孔板，诱导分化并处理后收集培养液，以500 g离心5 min（半径13.5 cm），收集上清液以试剂盒测定其中L-乳酸的浓度。同时收集细胞，匀浆后以试剂盒测定其中的ATP浓度，结果以样品的蛋白含量进行校正。

1.2.4 Western blot  L6细胞以1×106/孔的密度接种于6孔板，诱导分化并处理后按照文献[3]报道的方法提取细胞总蛋白，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blot检测。按文献[3]报道的方法对蛋白条带进行扫描和定量，以ACTB为内参对GLUT4的表达水平进行校正，以AMPKα或Akt为内参对p-AMPKα和p-Akt的表达水平进行校正。所有靶蛋白的表达水平均以对照细胞的倍数表示。

1.2.5 细胞RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR  L6细胞接种于6孔板，诱导分化并处理后以试剂盒提取细胞总RNA，定量后取1 μg为模板进行反转录，反应体系和条件参考文献[3]报道。以Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System进行扩增，引物和反应条件参考文献[3-4]报道。以ACTB为内参校正，以比较循环阈值（Ct）法对GLUT4 mRNA的表达水平进行相对定量，结果以对照细胞的倍数表示。

1.3 统计学方法

以GraphPad Prism 6软件进行统计分析，计量资料以3次独立实验的均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSTD显著促进L6肌管的糖消耗

如图1A所示，GSTD处理后显著促进L6肌管的基础糖消耗，其作用呈浓度依赖性。125 μmol/L的GSTD即可使细胞糖消耗产生有统计意义的增加[与对照细胞比较，差异有统计学意义（P < 0.05）]，当其浓度达到500 μmol/L时，可使糖消耗较对照细胞平均升高约47.4%（P < 0.01）。除了基础糖消耗，GSTD作用于L6肌管还显著增加胰岛素刺激的糖消耗。如图1B所示，浓度为0.05 nmol/L的胰岛素与500 μmol/L的GSTD联合处理后，细胞糖消耗较二者单独处理增加更为明显（P < 0.05）。浓度为5 mmol/L的阳性对照药Met也显著促进L6肌管的基础糖消耗和胰岛素刺激的糖消耗，其作用与500 μmol/L的GSTD相当。

与胰岛素敏感细胞比较，浓度为100 nmol/L的胰岛素处理后生理盐水组细胞的基础糖消耗出现有统计意义的减少（P < 0.05或P < 0.01），而且再以0.05 nmol/L的胰岛素处理，细胞糖消耗不能增加，提示胰岛素抵抗状态诱导成功（图1C）。浓度为500 μmol/L的GSTD和5 mmol/L的Met在胰岛素抵抗状态下也能增加L6肌管的糖消耗[与生理盐水处理的胰岛素抵抗细胞比较，差异有统计学意义（P < 0.05）]，但药效较同样处理的胰岛素敏感细胞弱（P < 0.05）。

A：L6肌管基础糖消耗。与对照细胞比较，*P < 0.05，**P < 0.01。B：胰岛素刺激的糖消耗。与对照细胞比较，**P < 0.01;与单用胰岛素、GSTD或Met的细胞比较，#P < 0.05。C：胰岛素抵抗状态下的糖消耗。与生理盐水处理的胰岛素敏感细胞比较，**P < 0.01;与相同处理的胰岛素敏感细胞比较，#P < 0.05，##P < 0.01;与生理盐水处理的胰岛素抵抗细胞比较，$P < 0.05。GSTD：天麻素;Met：二甲双胍

2.2 GSTD不影响L6肌管的糖酵解

Met显著增加L6肌管L-乳酸的释放并抑制ATP产生[与对照细胞比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）]。而各浓度的GSTD对L6肌管的L-乳酸（图2A）和ATP（图2B）的产生均没有影响，提示其不影响细胞糖酵解。

2.3 GSTD显著上调L6肌管GLUT4的表达并激活AMPK和Akt通路

GSTD处理后浓度依赖性地上调L6肌管GLUT4蛋白（图3A）和mRNA（图3B）的表达[与对照细胞比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）]。GSTD还能激活L6肌管的AMPK和Akt信号通路，表现为p-AMPKα（Thr172）和p-Akt（Ser473）的水平显著增加[与对照细胞比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）]。浓度为5 mmol/L的Met上调GLUT4、激活AMPK和Akt的作用与500 μmol/L的GSTD相当。

3 讨论

本研究探讨了GSTD在L6骨骼肌细胞中调控糖代谢的作用和初步机制，并首次报道了其促进细胞糖消耗的作用和对GLUT4表达的上調作用。

本研究发现GSTD增加细胞糖消耗的机制与Met不完全相同。Met能通过抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ来抑制葡萄糖的有氧氧化和ATP合成，从而促进葡萄糖的无氧酵解和乳酸释放，增加细胞糖消耗[4]。而GSTD对细胞糖酵解和ATP的产生没有影响，提示其对细胞的线粒体功能不产生抑制作用。事实上，有研究发现GSTD在神经细胞中能改善线粒体功能并增加线粒体膜电位[6]。

GSTD增加L6肌管糖消耗的作用与GLUT4的上调以及AMPK和Akt的激活有关。笔者实验室以前的研究发现GSTD作用于肝细胞能显著激活AMPK[7]，另有研究发现GSTD作用于心肌细胞能激活Akt通路[8]，本研究结果与之相符。GLUT4是L6细胞中最主要的葡萄糖转运载体[9-10]，AMPK和Akt是调控糖代谢的关键激酶，激活后二者均能促进GLUT4的细胞膜转位，从而刺激细胞对葡萄糖的摄取和消耗[11-14]。目前GSTD对L6肌管GLUT4转位和葡萄糖摄取的影响以及与AMPK和Akt信号通路的相关性尚属未知，需进行深入研究。

除了基础糖消耗，GSTD还显著增加胰岛素刺激的糖消耗并且在胰岛素抵抗的L6肌管中仍具有促进糖代谢的活性，这些体外实验的结果与其在动物实验中的胰岛素增敏作用相符合[2，15]。GSTD增加胰岛素敏感性和改善胰岛素抵抗的分子机制尚不明确，有可能与其抑制同型半胱氨酸的作用[16]以及抗炎和抗氧化活性[7]有关。笔者实验室正就GSTD的胰岛素增敏作用和对胰岛素信号通路的影响进行深入研究。

综上所述，本研究结果提示GSTD作用于L6骨骼肌细胞能显著促进基础糖消耗和胰岛素刺激的糖消耗，并且在胰岛素抵抗状态下仍然有效，其作用机制与糖酵解无关，但可能与GLUT4表达上调以及AMPK和Akt通路的激活有关。结合其在糖尿病动物模型中的良好效果[1-2]，GSTD在将来有可能开发成为新型的口服降糖药。

[参考文献]

[1]  韩磊，乔爱敏，刘青.天麻素的抗糖尿病作用实验[J].华侨大学学报：自然科学版，2013，34（6）：682-686.

[2]  张勇，武燕彬，孔维佳.天麻素在KK-Ay小鼠中抗糖尿病作用的实验研究[J].中国药理学通报，2018，34（7）：917-924.

[3]  Shan YQ，Ren G，Wang YX，et al. Berberine analogue IMB-Y53 improves glucose-lowering efficacy by averting cellular efflux especially P-glycoprotein efflux [J]. Metabolism，2013，62（3）：446-456.

[4]  Xu M，Xiao Y，Yin J，et al. Berberine promotes glucose consumption independently of AMP-activated protein kinase activation [J]. PLoS One，2014，9（7）：e103702.

[5]  Liu LZ，Cheung SC，Lan LL，et al. Berberine modulates insulin signaling transduction in insulin-resistant cells [J]. Mol Cell Endocrinol，2010，317（1/2）：148-153.

[6]  蒋根灵，李庆林.天麻素通过下调ERK1/2-p38信号通路保护谷氨酸损伤的PC12细胞[J].安徽中医学院学报，2013，32（3）：71-75.

[7]  Qu LL，Yu B，Li Z，et al. Gastrodin ameliorates oxidative stress and proinflammatory response in nonalcoholic fatty liver disease through the AMPK/Nrf2 pathway [J]. Phytother Res，2016，30（3）：402-411.

[8]  Yang P，Han Y，Gui L，et al. Gastrodin attenuation of the inflammatory response in H9c2 cardiomyocytes involves inhibition of NF-κB and MAPKs activation via the phosphatidylinositol 3-kinase signaling [J]. Biochem Pharmacol，2013，85（8）：1124-1133.

[9]  Richter EA，Hargreaves M. Exercise，GLUT4，and skeletal muscle glucose uptake [J]. Physiol Rev，2013，93（3）：993-1017.

[10]  Hajiaghaalipour F，Khalilpourfarshbafi M，Arya A. Modulation of glucose transporter protein by dietary flavonoids in type 2 diabetes mellitus [J]. Int J Biol Sci，2015，11（5）：508-524.

[11]  Day EA，Ford RJ，Steinberg GR. AMPK as a therapeutic target for treating metabolic diseases [J]. Trends Endocrinol Metab，2017，28（8）：545-560.

[12]  Lee JO，Lee SK，Kim JH，et al. Metformin regulates glucose transporter 4（GLUT4）translocation through AMP-activated protein kinase（AMPK）-mediated Cbl/CAP signaling in 3T3-L1 preadipocyte cells [J]. J Biol Chem，2012，287（53）：44121-44129.

[13]  Waldhart AN，Dykstra H，Peck AS，et al. Phosphorylation of TXNIP by AKT mediates acute influx of glucose in response to insulin [J]. Cell Rep，2017，19（10）：2005-2013.

[14]  Rowland AF，Fazakerley DJ，James DE. Mapping insulin/GLUT4 circuitry [J]. Traffic，2011，12（6）：672-681.

[15]  Kim MJ，Yang HJ，Moon BR，et al. Gastrodia elata Blume rhizome aqueous extract improves arterial thrombosis，dyslipidemia，and insulin response in testosterone-deficient rats [J]. Evid Based Complement Alternat Med，2017， 2017：2848570.

[16]  白永，范曉明，郭家智，等.天麻素对胰岛素抵抗模型中CBS表达的影响[J].昆明医科大学学报，2014，35（4）：6-9.

（收稿日期：2018-06-12  本文编辑：张瑜杰）