脉络通颗粒HPLC指纹图谱研究

2019-04-04俞洁东曾海松吴革林等

中国医药导报 2019年4期

俞洁东曾海松吴革林等

[摘要] 目的建立脉络通颗粒高效液相（HPLC）指纹图谱，并采用三重四极杆液质联用（LC-MS）系统对其化学成分进行定性分析，为脉络通颗粒的质量评价提供依据。方法采用Phenomenex Luna C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.3%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长270 nm。测定10批脉络通颗粒，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）建立脉络通颗粒HPLC指纹图谱，采用正、负离子模式对共有峰进行成分分析，并通过现有对照品进行确认。结果建立了脉络通颗粒HPLC指纹图谱，共标定了21个共有峰，分别归属到了8味药材，液质联用系统指认了其中19个共有峰，其中7个采用对照品对比确认。结论该方法重现性好、特征性强，能为脉络通颗粒的质量控制提供依据，并可为其他中药复方的物质基础研究提供参考。

[关键字] 脉络通颗粒;指纹图谱;共有峰;三重四级杆液质联用系统

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2019）02（a）-0039-04

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint of Mailuotong Granules， and qualitatively analyze its chemical composition by triple quadrupole liquid chromatography-mass （LC-MS） system， and provide evidence for the quality evaluation of Mailuotong Granules. Methods Phenomenex Luna C18 （2） column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used. Acetonitrile-0.3% formic acid solution was used as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 25℃， and the detection wavelength was 270 nm. Ten batches of Mailuotong Granules were determined. The fingerprint of Mailuotong Granules was established with Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine （2004A edition）. The common peaks were analyzed by positive and negative ion modes， and confirmed by the existing reference substances. Results The HPLC fingerprints of Mailuotong Granules were established. A total of 21 common peaks were identified and assigned to 8 herbs. The LC/MS system identified 19 common peaks， 7 of which were confirmed by comparison. Conclusion The method has good reproducibility and strong characteristics， which can provide a basis for the quality control of Mailuotong Granules and provide reference for the material basic research of other traditional Chinese medicine compounds.

[Key words] Mailuotong Granules; Fingerprint; Common peak; Triple quadrupole liquid chromatography-mass system

脈络通颗粒是由党参、当归、地龙、丹参、红花、木贼、葛根、槐米、山楂、川芎等10味药材制成，具有益气活血、化瘀止痛等功效，用于胸痹引起的心胸疼痛、胸闷气短、头痛眩晕及冠心病心绞痛诸症，以及中风引起的肢体麻木、半身不遂等症。目前，药理和主成分含量测定及大孔树脂有机残留物[1-4]是其研究热点，但缺少整体评价的质控方法，无法满足中药现代化的要求。

中药指纹图谱具有整体性、模糊性和特征性，是国内外广泛认可的中药质量评价手段[5-10]。液质联用技术具有的高效液相色谱的高分离效能和质谱的高灵敏度、高选择性的特点，是控制中药质量的有力工具。本研究建立了脉络通颗粒的高效液相指纹图谱，共标定了21个共有峰，并将其归属到各药味;采用液质联用技术和对照品指认法对其化学成分进行指认，为脉络通颗粒的物质基础研究提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（配四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器）、Agilent 6460 Triple Quad LC/MS三重串联四极杆（配有ESI电源、Agilent Mass Hunter数据处理软件），美国Agilent公司;XPE-205十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo仪器有限公司）、KQ-250型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

葛根素（生产批号：110752-201514）、芦丁（生产批号：100080-200707）、阿魏酸（生产批号：110773-201614）、党参炔苷（生产批号：111732-200905）、丹酚酸B（生产批号：11562-201111）、槲皮素（生产批号：10081-9905）、山柰素（生产批号：110861-201310）均购于中国食品药品检定研究院;脉络通颗粒（扬子江药业集团有限公司）。

乙腈为色谱纯（德国Merck KGaA公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件色谱柱为Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为乙腈-0.3%甲酸溶液，梯度洗脱：0～3 min，5%乙腈;3～50 min，5%～42%乙腈;50～50.1 min，42%～95%乙腈;50.1～60 min，95%乙腈;流速1.0 mL/min，柱温25℃，检测波长270 nm，进样量5 μL。

2.1.2 质谱条件采用ESI电离源，正离子模式下：毛细管电压3500 V，雾化器压力35 psi，干燥气温度300℃，干燥气体积流量10 L/min，鞘气温度350℃，鞘气流速11 L/min，碎片电压135 V，喷嘴电压1000 V，质量扫描范围m/z 500～1200;负离子模式下条件与正离子模式相同。

2.2 溶液制备方法

2.2.1 混合对照品溶液制备取葛根素、芦丁、阿魏酸、党参炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含葛根素112 μg、芦丁204 μg、阿魏酸44 μg、党参炔苷32 μg、丹酚酸B 92 μg、槲皮素40 μg、山柰素28 μg的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备取脉络通颗粒2.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，称定重量，超声（250 W，40 kHz）处理20 min，放冷，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度取脉络通颗粒（生产批号：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。以最高峰芦丁为参照峰，计算标定峰的相对保留时间和相对峰面积，并对图谱进行相似度比较。结果各峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均≤3.0%，图谱间的相似度均为1.000，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性取脉络通颗粒（生产批号：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液。以最高峰芦丁为参照峰，计算标定峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，并对图谱进行相似度比较。结果各峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均≤3.0%，图谱间的相似度均为1.000，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性取脉络通颗粒（生产批号：16102381）2.0 g，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制样后0、2、4、8、12、16、20、24 h进样，记录色谱图。以最高峰芦丁为参照峰，计算标定峰的相对保留时间和相对峰面积，并对图谱进行相似度比较。结果各峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均≤3.0%，图谱间的相似度均为1.000，表明样品稳定性良好。

2.4 指纹图谱分析

2.4.1 对照指纹图谱的建立将收集到的14批样品按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。随机取10批脉络通颗粒的色谱信息，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）对10批样品进行分析，以S1为参照采用中位数法生成对照指纹图谱（R），共标定21个共有峰。见图1。

2.4.2 指纹图谱分析将测定获得的14批样品的色谱信息采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）与生成的对照指纹图谱（R）进行相似度比较评价。14批脉络通颗粒相似度均在0.9以上，说明产品的质量稳定性良好。见表1。

2.5 色谱峰指认

2.5.1 对照品法指认利用对照品对各色谱峰的成分进行指认。通过比较各峰的保留时间和紫外吸收光谱确定了7个化合物，分别为葛根素、芦丁、阿魏酸、党参炔苷、丹酚酸B、槲皮素、山柰素。见图2。

2.5.2 高效液相色谱-质谱法指认

比较ESI负离子和ESI正离子模式条件下供试品溶液的信息情况，发现党参酸在ESI负离子模式条件下无响应，山柰素在ESI正离子模式条件下响应较弱。见图2～3。

通过对各成分质谱裂解信息的分析，对脉络通颗粒中的化学成分进行结构推测。在对照品法指认的7个成分的基础上又推测出12个成分。结合文献[10-21]對HPLC-MS法和对照品指认法确认的共19个化合物进行归属，分别归属到8味药材，即党参、当归、丹参、木贼、葛根、槐米、山楂、川芎。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法考察

本研究分别对提取溶剂（10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇）、提取溶剂体积（25、50、75 mL）、提取方式（超声、回流）、提取时间（5、10、20、30、40 min）进行了考察，结果最佳提取方法为加70%乙醇50 mL超声提取20 min。

3.2 色谱条件考察

本研究分别对洗脱系统（乙腈-水、乙腈-酸水、甲醇-水、甲醇-酸水）、酸及浓度（甲酸、乙酸、磷酸）、柱温（20℃、25℃、30℃）、检测波长及色谱柱进行了考察，最终确定色谱条件为色谱柱Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为乙腈-0.3%甲酸溶液，梯度洗脱，柱温25℃，检测波长270 nm。

本研究建立了脉络通颗粒的HPLC指纹图谱，共标定21个化合物，并用高效液相色谱-质谱法鉴定了其中19个化合物，其中7个化合物采用对照品进行比对。本品共由10味药材组成，已鉴定的化合物分别归属于8味药材，提示本研究建立的指纹图谱符合指纹图谱对整体性的要求。

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