反相离子对色谱联合电感耦合等离子体质谱法测定环境水样中5种形态硒

2019-04-04

分析仪器 2019年2期

(1.浙江省环境监测中心, 杭州 310012；2.上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司,上海 200082；3.浙江树人大学杭州, 310015)

硒是人体必需的微量营养元素，近20年来，越来越多的研究发现硒具有清除自由基、抗癌、保护肝脏、防衰老、增强免疫等生物学功能[1-4]。但是不同形态的硒化合物的营养学性质和毒理学性质相差很大。自然界中硒的存在形态分为无机硒和有机硒。一般情况下无机硒过量会导致有机生物体的中毒反应，而有机硒具有相对较高的生物利用度。有机硒和无机硒在环境迁移过程中还可以相互转化。因此，为获得硒在环境和人体内的存在形式及迁移转化规律、评价其生物毒性，不仅需要测定其总量，还必须进行形态分析。

环境样品中无机硒主要有单质硒、硒化物、亚硒酸盐和硒酸；有机硒主要有硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、甲基-硒代半胱氨酸、硒代乙硫氨酸等。由于硒的不同化学形态中既含有硒元素，又具有有机物的性质，因此，将有机物分离技术如高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)与某些特征元素检测技术，如原子荧光(AFS)、质谱(MS)等相结合的联用技术是目前形态硒检测方法的发展趋势[5]。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用作为一种高灵敏的分析测试技术在金属及类金属形态分析领域得到了广泛应用。这主要是因为HPLC具有高效的分离能力，而ICP-MS具有较低的检测限、宽泛的动态线性范围、良好的分析精密度等优点。目前HPLC-ICP-MS测定形态硒的报道中最常采用的液相柱为Hamilton PRP阴离子交换柱[6-11]，其次为Waters Symmetry Shield RP18[12-13]和C18[14,15]等。

使用C8柱进行形态硒测定的报道极为少见，仅辛晓东等人[16]采用C8柱，以0.15mmol/LEDTA(钾)-0.1mmol/L四丁基氢氧化铵-0.15mmol/L乙酸铵-5%甲醇为流动相，分离出了水样中2种无机硒化物(Se(IV)和Se(VI))；吕亚宁等人[17]采用C8柱，以0.1mmol/L四丁基氢氧化铵-0.1mmol/L乙酸铵-10%甲醇为流动相，分离出了果汁样中Se(IV)和Se(VI)。本研究以C8柱作为分离柱，采用0.1%七氟丁酸-20mmol/L磷酸二氢钾-5%甲醇混合溶液为流动相，建立了水样中5种硒形态(硒酸根、亚硒酸根、硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸)的HPLC-ICP-MS分析方法，该法高效、简便、线性范围宽、灵敏度高、重现性好，适用于环境水体中硒形态的分析测定。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

仪器：iCAP RQ型电感耦合等离子体质谱仪(美国赛默飞世尔科学(中国)有限公司)；ICS-1500型液相色谱(美国戴安公司)；Mili-Q纯水机(美国Millipore公司)。

标准品：硒酸根(GBW10033,41.5±1.3μg/g以硒计)、亚硒酸根(GBW10032,42.9±0.9μg/g以硒计)、甲基-硒代半胱氨酸(GBW10088,34.8±1.0μg/g以硒计)、硒代胱氨酸(GBW10087,44.2±1.0μg/g以硒计)，均购于中国计量科学研究院；硒代蛋氨酸(纯度98%)，购于北京百灵威科技有限公司。

试剂：甲醇(色谱纯)，购于美国Fisher公司；磷酸二氢钾(分析纯)，购于临平化工试剂厂；七氟丁酸(纯度99%)，购于赛默飞世尔科学(中国)有限公司；实验用水由Mili-Q纯水机制备(电导率>18.2MΩ?cm)；色谱进样前所有样品均经0.22μmPES聚醚砜滤膜(德国Membrance公司)过滤。

1.2 检测条件

HPLC条件：色谱柱：Hypersil Gold C8(250mm×4.6 mm×5 μm)；等度分离流动相：20mmol/L磷酸二氢钾-0.1%七氟丁酸-5%甲醇；流速：1.2mL/min。

ICP-MS条件： ICP发射功率为1550W；雾化气流量为0.90L/min；冷却气流量为14.0 L/min；辅助气流量为0.8L/min；碰撞气流量为4.5mL/min；驻留时间为0.1ms，检测同位素为78Se。

1.3 标准储备液与工作液的配制

准确移取适量硒酸根、亚硒酸根、硒代胱氨酸和甲基-硒代半胱氨酸，配制成1.00mg/L单标中间液。用万分之一电子天平准确称取0.0127g硒代蛋氨酸固体标准品，加入适量超纯水，用超声波中完全溶解，转移定容至100mL容量瓶中，配制得到50mg/L储备液；使用时，将其稀释至1.00mg/L。取所有单标，用超纯水逐级稀释成系列浓度的混合标准工作液。

1.4 样品处理及分析测定

水样用0.22μmPES聚醚砜滤膜(德国Membrance公司)过滤后即可直接进样，进样体积：25μL。

2 结果及讨论

2.1 ICP-MS测定同位素的选择

硒有6种同位素，分别是74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se，其中80Se的丰度最大(49.96%)，其次是78Se(23.61%)和82Se(8.84%)。但是78Se、80Se和82Se均存在不同程度的质谱干扰，如80Se会受到40Ar40Ar的严重干扰，78Se受到40Ar38Ar,38Ar40Ca的干扰、82Se受到40Ar42Ca的干扰。本研究采用碰撞池技术，以氦气为碰撞气来消除质谱干扰。杨修斌等人[6]同时对78Se、80Se和82Se3种同位素进行了转基因大豆中形态硒分析，结果表明在碰撞池模式下3种同位素被检测时所得色谱峰形保持一致，即在碰撞池模式下多原子离子干扰质谱干扰可被消除至可以忽略不计。环境水体的基体比较简单，为了尽可能避免质谱干扰，本研究未采用质谱干扰最严重的80Se，而用78Se作为最终的检测同位素。

2.2 流动相pH的影响

在硒的形态分析中常用到三氟乙酸、五氟丙酸和七氟丁酸等全氟羧酸[12]，或者添加烷基磺酸钠、氢氧化四甲基铵等反相离子对试剂[16]作为流动相成分。反相离子对色谱中，影响化合物保留时间的因素有配对离子、流动相性质、相比，柱温和离子强度等。本研究以Hypersil Gold C8(250mm x 4.6 mm x 5 μm)为分离柱，流动相为0.1%七氟丁酸，含3%甲醇，流速1.0mL/min，实验了在流动相中(1)不加离子强度剂；(2)分别加入10mmol/L、20mmol/L和30mmol/L氯化铵调节离子强度；(3)分别加入10mmol/L、20mmol/L、25 mmol/L和30mmol/L磷酸二氢钾调节离子强度这3组情况下硒酸根、亚硒酸根、硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸在柱上的分离情况。结果表明：(1)不加离子强度剂时5种硒化物仅出来2个峰。测定该流动相，其pH值约为2.5；(2)加入不同浓度的氯化铵时硒酸根和亚硒酸根不能分开，但3种有机硒有较好的分离效果。测定该流动相的pH值，发现加入氯化铵后流动相呈中性。(3)加入10mmol/L磷酸二氢钾时硒酸根和亚硒酸根得到了有效分离，但3种有机硒不能完全分开。提高磷酸二氢钾的浓度至20mmol/L以上时，5种硒化物分离效果令人满意。测定该流动相的pH值约为3左右。

各种硒形态在不同pH条件下以阳离子、阴离子或两性离子的形式存在[18]，因此流动相的酸度直接影响了各硒化合物的离子存在形态。在酸性条件下，有机硒可被质子化形成阳离子，可与七氟丁酸阴离子形成较稳定离子对，在柱上有一定的保留能力。同时，有机硒化合物由于具有一定的疏水性，本身也能在柱上吸附。两种无机硒化物硒酸根(pK21.7)和亚硒酸(pK12.46，pK27.31)在水溶液中主要以酸根阴离子形式存在，较难与七氟丁酸形成稳定的离子对，因而在柱子上保留时间很短，几乎在死时间即均被洗脱，很难得到有效分离。本研究加入适量浓度的磷酸二氢钾时流动相的pH值<4，一部分亚硒酸可能未发生离解[6]，使得硒酸根和亚硒酸根的物理性质不同而在色谱柱上得到了有效分离。实验结果发现，随着磷酸二氢钾浓度的提高，硒酸根、亚硒酸根、硒代胱氨酸、甲基-硒代半胱氨酸在柱上的保留时间均略有提前，但提前幅度不大；硒代蛋氨酸保留时间有明显提前。考虑到流动相中高浓度磷酸二氢钾基体会在进入ICP-MS进行定量检测时易沉积在锥孔上产生严重的基体效应，本研究最终选择加入20mmol/L磷酸二氢钾作为离子强度调节剂。增加流动相中甲醇含量可以降低流动相的极性，使离子对在管柱内的保留时间缩短，但过量的甲醇会使电流不稳定，且易导致ICP点火失败，本文参照辛晓东等人[16]的研究结果，选择流动相中加入甲醇的浓度为5%。同时，为了进一步提高分离效率，设置流动相流速为1.2mL/min。

2.3 标准曲线和检出限

采用本实验建立的方法进行检测，在10min内5种硒形态均得到了很好的分离，色谱图见图1。按照《环境监测分析方法标准制修订技术导则》HJ168—2010的规定，对空白样品加入0.5μg/L硒混标标样连续测定7次，以3.14倍标准偏差计算检出限。各形态硒的线性范围、线性方程和检出限见表1。GB/T14848—2017《地下水质量标准》和GB3838—2002《地表水环境质量标准》中Ⅰ类水体中硒的限值为0.01mg/L，本研究建立方法的检出限比该值低2个数量级，满足环境水体的检测要求。

图1 5种硒形态标准溶液的色谱图(50μg/L)

硒形态线性范围(μg/L)线性回归方程相关系数方法检出限(μg/L)硒酸根1～100A=1196.8C+320.61.0000.13亚硒酸根1～100A=1406.2C+573.91.0000.09硒代胱氨酸1～100A=1385.5C+679.81.0000.10甲基-硒代半胱氨酸1～100A=1228.2C+632.91.0000.07硒代蛋氨酸1～100A=1209.8C+4151.0000.23

2.4 实际样品的测定

对某地表水、地下水和自来水管末梢水3个环境水样进行了形态硒检测，除该地下水样品中硒酸根和亚硒酸根有检出外，其余样品均未检出硒化物。地下水色谱图见图2，检测浓度结果见表2。

图2 某地下水及其加标样的形态硒色谱图(a).地下水；(b).地下水加标0.5μg/L

μg/L

目前市面上无在售的形态硒混合标准水样。为验证方法的准确性和精密度，分别进行了加标回收和平行测定实验。在表2地表水样品中添加低、中、高3种浓度的标准溶液，每个添加浓度平行测定6次，加标回收率范围为76.1%～93.1%，样品平行测定RSD%范围为1.6%～13.6%，结果见表3。实验结果表明，本研究建立的反相离子对色谱联合电感耦合等离子体质谱法，可在10min内有效分离测定环境水体中的5种形态硒，方法简便、快速、灵敏度高、精密度好，在环境水体元素形态分析中具有良好的应用前景。