紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响

李红梅，王显

针对介入术后仍有10%~20%再狭窄率及支架血栓形成风险，防治支架内再狭窄成为介入领域的研究热点[1-3]。随着研究的逐步深入，经皮冠状动脉介入术（PCI）后炎症状态与再狭窄之间的相关性得到肯定，诸多通过抗炎防治再狭窄的治疗策略层出不穷，从口服抗炎调整全身炎症状态，到药物涂层支架的局部抗炎治疗，再到可降解支架的技术革新，抗炎成为防治PCI术后再狭窄新的突破口[4-7]。

既往国外利用重组水蛭素与依洛前列环素组成复合物，研制出新一代内皮“友好型”药物支架，在动物实验中抗栓疗效肯定，并能有效减少冠状动脉再狭窄面积[8]。内皮“友好型”复合载药技术为我们提供了重要的研究思路，创新性寻找两种单体组成复合物涂载于球囊或支架系统可能对降低介入术后再狭窄和预防血栓形成起到更为积极的作用。在此思路指导下，本团队自主研发了紫杉醇水蛭素复合物作为目前药物支架/球囊涂层药物的创新示范，其中水蛭素具有生物免疫原性，能更好的作为引导血管组织“修复”的模版，起到抗再狭窄和预防血栓形成的双重作用，是目前最完美的药物涂层支架/球囊设计理念。本团队前期的动物实验表明，紫杉醇水蛭素复合药物涂层球囊能有效抑制血管内膜增生，球囊涂层的天然水蛭素比常规的优维显能够更好的作为紫杉醇的载体，促进内皮愈合，抑制血栓形成，优化单一紫杉醇涂层所带来的内皮化延迟问题，在抗再狭窄形成方面优势明显。

基于上述背景，本研究运用MTT法，观察不同配比条件下的紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC活力的影响，确定最佳的紫杉醇水蛭素支架涂层复合物大、小两个浓度，使细胞活力保持在90%以上。综合应用Q-PCR、Western blot法探究紫杉醇水蛭素支架涂层复合物大、小两个浓度对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88炎症通路各主要位点的基因和蛋白表达水平的影响，初步阐释紫杉醇水蛭素支架涂层复合物的抗炎机制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要试剂 HCASMC（货号：FC-0031）、平滑肌细胞培养基、胰酶、胰酶抑制剂、冻存液均购自美国Lifeline公司；细胞培养级脂多糖1mg/ml（货号：L6529），Sigma（L2880）；紫杉醇储存液100ul（KGA8221），南京凯基生物科技发展有限公司；科研级天然水蛭素冻干粉瓶装500AT-U/g，武汉胜天宇生物科技有限公司；兔TLR4多克隆抗体（ab30667），abcam公司；兔MyD88多克隆抗体（ab119048），abcam公司；HRP标记的羊抗兔IgG（BA1050），武汉博士德公司；TRIZOL通用型RNA快速提取试剂盒，inventrogen公司产品；反转录试剂盒，美国Bio-Rad公司。

1.1.2 主要仪器 超净工作台CJT-E-Ⅱ（北京昌平长城空气净化工程公司）、倒置相差显微镜（Olympus CKX×41）、低速离心机LD4-2（北京雷勃尔离心机有限公司）、培养箱（MCO-20AIC，SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低温冰箱（美国REVCO Legaci）、电热恒温水箱（HH.W21.420）、荧光PCR仪、SDS-PAGE凝胶电泳仪、电转仪均为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞准备及处理 实验使用第4-6代细胞，将生长至融合期的HCASMC以胰蛋白酶消化，细胞悬液接种于6孔细胞培养板，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，待细胞融合成单层开始实验。

1.2.2 MTT法筛选出紫杉醇水蛭素支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围，使细胞活力保持在90%以上 实验共分为8组，每组6个复孔，空白对照组不加入紫杉醇水蛭素复合物干预，其余各组加入不同配比的紫杉醇水蛭素复合物干预48 h，具体分组如下：①空白对照组；②1 μmol/L的紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素组；③1 μmol/L的紫杉醇+0.025 mg/ml水蛭素组；④1 μmol/L的紫杉醇+0.05 mg/ml水蛭素组；⑤1 μmol/L的紫杉醇+0.1 mg/ml水蛭素组；⑥1 μmol/L的紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素组；⑦1 μmol/L的紫杉醇+0.4 mg/ml水蛭素组；⑧1 μmol/L的紫杉醇+0.8 mg/ml水蛭素组。

1.2.3 Q-PCR法测定紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中炎症通路关键分子TLR4和MyD88的mRNA表达 将实验分为4组：①空白对照组；②LPS造模组；③LPS造模+紫杉醇水蛭素大浓度组；④LPS造模+紫杉醇水蛭素小浓度组。用TRIZOL通用型RNA快速提取试剂盒提取样品RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，按照以下反应体系进行：模板（RNA）1 μg；5x Reaction Mix 4 μl；Reverse Transcriptase 1 μl；DEPC处理水至20 μl，混匀，25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃5 min。Q-PCR检测按照以下反应体系进行：模板（cDNA）/ddH2O，7.5 μl；4 μM引物F/R，5 μl；SYBR 12.5 μl，混匀，置于荧光定量PCR仪中。数据处理：目的基因的相对表达量用ΔΔCT法计算，ΔCT（目的基因）=CT（目的基因）－CT（内参基因），ΔΔCT=ΔCT（处理组）－ΔCT（空白组）。目的基因的相对表达水平=2-ΔΔCT ，数据用Excel进行统计分析，荧光实时定量PCR结果均用均值±标准误表示，其中各基因的表达量所示结果均经过内参β-actin表达量进行校正。

1.2.4 Western blotting法测定紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中炎症通路关键分子TLR4和MyD88的蛋白表达 将实验分为4组：①空白对照组；②LPS造模组；③LPS造模+紫杉醇水蛭素大浓度组；④LPS造模+紫杉醇水蛭素小浓度组。提取细胞总蛋白，1.25x SDS 50 μl混匀后100℃煮20 min变性。将10 μl蛋白样品加于12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳3 h，然后电转90 min至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入TLR4、MyD88一抗（1:1000稀释）、β-actin一抗（1:1000稀释），4℃过夜，洗涤后加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG（1:2000稀释），室温孵育1h，洗涤后发光压片，用凝胶图像扫描仪进行半定量分析。

1.3 统计学处理 用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法摸索紫杉醇水蛭素支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性浓度范围 MTT结果显示：1 μmol/L的紫杉醇配比0.8 mg/ml水蛭素对HCASMC生长有明显的抑制作用，细胞活力与空白对照组相比差异明显（P＜0.05）。1 μmol/L的紫杉醇配比0.4 mg/ml水蛭素干预后细胞活力降低为78.7%，对细胞生长产生了一定影响，其余各浓度组细胞活力均能保持在90%以上，因此紫杉醇水蛭素支架涂层复合物的无毒性大、小两个浓度分别为：大浓度组1 μmol/L的紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素；小浓度组1 μmol/L的紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素（表1）。

表1 紫杉醇水蛭素支架涂层复合物不同配比对HCASMC活力的影响

2.2 Q-PCR法检测紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中炎症通路关键分子TLR4和MyD88基因表达的影响 Q-PCR结果显示：与空白对照组相比，LPS造模后可同时激活TLR4、MyD88基因表达（P＜0.05），HCASMC炎症模型构建成功。各干预组经紫杉醇水蛭素处理后，与LPS造模组相比，TLR4的基因表达量显著降低（P＜0.05），但不影响MyD88的基因表达（P＞0.05）（图1，图2）。

图1 紫杉醇水蛭素对TLR4 mRNA的影响

图2 紫杉醇水蛭素对MyD88 mRNA的影响

2.3 Western blot法检测紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中炎症通路关键分子TLR4和MyD88蛋白表达的影响 Western blotting结果显示：与空白对照组相比，LPS模型组TLR4及MyD88蛋白表达明显升高（P＜0.05），成功构建了稳定的HCASMC炎症模型。经紫杉醇水蛭素处理后，各干预组TLR4和MyD88蛋白表达较LPS模型组显著降低（P＜0.05），其中紫杉醇水蛭素大浓度组的抗炎作用相对更强（图3~4）。

图3 紫杉醇水蛭素复合物对LPS诱导HCASMC活化过程中通路关键蛋白表达的影响

图4 紫杉醇水蛭素复合物对HCASMC活化过程中炎症通路关键蛋白表达的影响

综合上述结果，紫杉醇水蛭素复合物可显著抑制TLR4-MyD88信号通路关键分子TLR4的基因和蛋白表达，但对MyD88的调控较为特殊，仅下调MyD88蛋白表达而不影响其基因表达，这为我们下一步的机制研究提供了思路，后续研究将以MyD88为突破口，对其抗炎机制进行更深层次的挖掘。

3 讨论

针对PCI后再狭窄难题，目前以细胞微管抑制剂紫杉醇作为涂层药物的支架或球囊以其稳定的安全性和有效性广泛应用于临床。从TAXUS-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ到著名的亚洲/欧洲紫杉醇涂层支架评价（ASPECT/ELUTES研究）等多中心、前瞻性临床试验均证实[9,10]，紫杉醇涂层支架不仅能显著降低PCI后再狭窄发生率，还能大幅降低主要心血管不良事件的影响，这与紫杉醇干扰G2-M后期的有丝分裂阻断细胞周期进程有关[11]。然而近年大量研究发现[12-15]，单一的紫杉醇涂层支架/球囊治疗后仍有约10%~20%的再狭窄率，延迟的支架血栓形成更是限制了它在临床上的推广应用，需要进一步创新现有药物支架或球囊的研发理念，在抗再狭窄的防治中取得更大突破。

水蛭素作为直接的凝血酶抑制剂，是一种含有65个氨基酸的多肽，对凝血酶的直接抑制和/或灭活作用可不依赖于抗凝血酶Ⅲ、肝素辅因子Ⅱ、蛋白C和组织因子途径抑制物，能够同时作用于凝血酶的活性部位和底物识别部位，与肝素相比，其不被血小板灭活，还有抑制凝血酶诱发的血小板聚集作用，具备良好的抗凝血和抗血栓双重作用。水蛭素的重组衍生物比伐卢定在抗凝方面显示出优越效果，METRIX、BRIGHT研究均表明水蛭素更高级别衍生物比伐卢定（重组水蛭素）在抗栓治疗中疗效显著[16]。有研究在兔动脉损伤模型中发现，水蛭素短期治疗可减少新生内膜面积44%~59%，但口服治疗效果不佳，原因可能与水蛭素属于大分子多肽，不利于消化和代谢有关[17,18]。本团队在既往紫杉醇涂层材料基础上，选择直接的凝血酶抑制剂水蛭素取代水溶性载体优维显，与紫杉醇以最佳配比制备出紫杉醇水蛭素支架涂层复合物，探索此新型支架涂层材料的可行性、安全性及有效性并阐明其效应机制。本团队前期的动物实验表明，紫杉醇水蛭素复合药物涂层球囊能有效抑制血管内膜增生，球囊涂层的天然水蛭素比常规的优维显能够更好的作为紫杉醇的载体，促进内皮愈合，抑制血栓形成，优化单一紫杉醇涂层所带来的内皮化延迟问题，在抗再狭窄形成方面优势明显。

本研究充分利用LPS诱导的HCASMC炎性活化细胞模型，将大、小两个浓度的无毒性紫杉醇水蛭素支架涂层复合物预处理HCASMC，探索紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响，以期能从炎症角度对其抗再狭窄机制进行阐释。我们在前期研究基础上，进一步优化紫杉醇水蛭素支架涂层复合物的药物配比，用MTT法筛选不同配比条件下的复合药物组合对HCASMC活力的影响，选择使细胞活力保持在90%以上的紫杉醇水蛭素大、小两个浓度作为药物干预浓度，以排除紫杉醇水蛭素产生的细胞毒性对实验结果带来的影响。最终确定无毒性复合药物大浓度组为1 μmol/L的紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素；小浓度组为1 μmol/L的紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素。进而用紫杉醇水蛭素大、小两个浓度对LPS诱导的HCASMC炎症细胞模型进行干预，运用Q-PCR、Western blot法检测紫杉醇水蛭素干预后炎症通路中TLR4、MyD88蛋白和基因表达变化，结果发现：紫杉醇水蛭素支架涂层复合物干预HCASMC后可使炎性活化的TLR4-MyD88通路关键蛋白表达受到抑制，具体表现为通路上游节点的TLR4和MyD88蛋白表达量下降，显著抑制LPS启动的炎症反应。我们进一步对各位点的基因表达变化进行分析，结果发现，TLR4基因表达量在紫杉醇水蛭素支架涂层复合物干预后明显下调，且变化程度与对应的蛋白表达变化基本一致，而MyD88的基因表达不受紫杉醇水蛭素干预的影响，但蛋白表达却受紫杉醇水蛭素的抑制作用十分显著，且呈现出一定的剂量依赖性。这给我们一个重要启示：紫杉醇水蛭素支架涂层复合物的抗炎机制，可能与其对MyD88蛋白水平的调控有关。因此我们的后续研究将锁定MyD88位点，采用基因敲减或蛋白酶解调控等手段，对紫杉醇水蛭素支架涂层复合物的抗炎靶点和作用机制进行深入挖掘。