妊娠期高血压疾病中晚期糖基化终末产物及其受体、基质金属蛋白酶-9表达关系的研究

陈益民，李玲，曾艳萍，姚晨平

子痫前期是妊娠期特有的疾病，发生率占妊娠女性的2%~8%，严重威胁母婴健康，居我国孕产妇死亡原因的第二位[1]。妊娠期高血压疾病包括妊娠期高血压、子痫前期及子痫等，多发生在妊娠20周至产后2周内[2]。由于血压骤然升高，可使脑、肾、肝多脏器受损，孕妇可能出现胎盘早剥、大出血等，每年死于妊娠高血压疾病的患者大约有50万左右；对于胎儿的并发症更为严重，可导致胎儿的宫内发育迟缓、宫内窘迫、早产，甚至死亡[3]。妊娠高血压疾病对家庭及社会都会造成严重负担。减少妊娠高血压疾病，降低孕产妇死亡率已成为世界卫生组织千年发展的目标。

子痫前期与母胎间免疫不耐受、炎症及血管内皮功能障碍密切相关[4-6]。研究表明，过度的炎性反应在子痫前期发病中发挥重要作用[7]。过度炎症反应导致内皮细胞损伤，使血管通透性增加，蛋白丢失，从而出现子痫前期。晚期糖基化终末产物（AGEs）及其受体（RAGEs）在胎盘滋养细胞和血管内皮细胞有大量表达。AGEs与RAGEs受体结合后，引起细胞内氧化应激，促进各种炎症因子大量表达。细胞因子及炎症因子如转化生长因子-β1等可下调基质金属蛋白酶（MMP）的表达；同时一些炎症因子能诱导产生基质金属蛋白酶抑制物（TIMP），从而抑制MMP发挥作用[8]。本研究通过检测不同孕期孕妇外周血和胎盘糖基化终末产物（AGEs）、糖基化终末产物受体（RAGEs）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达水平，探讨三者在妊娠期高血压疾病发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月~2016年12月于解放军第421医院进行产前唐氏筛查的孕妇300例，定期追踪孕妇的妊娠情况，获得子痫前期7例，妊娠期高血压10例；同时选取妊娠结局正常、足月分娩、无任何并发症的16例孕妇为对照组。排除标准：慢性高血压；系统性红斑狼疮；糖尿病及妊娠期糖尿病；严重心肺疾病及肝肾功能不全等。且各组病例均为单胎妊娠孕妇。所有入选病例均符合纳入标准，签署知情同意书。经统计分析，各组孕妇妊娠中期采血时，各相关考察指标均无显著性差异（P＞0.05）（表1）。

1.2 样本的采集 进行唐氏筛查的孕妇上午7时~11时空腹抽静脉血，然后室温条件下离心（3000 r/min，8 min），取上清液置-80℃冰箱保存。

1.3 血清中AGEs、RAGEs及MMP-9浓度 采用双抗体夹心ELISA法测定孕妇血清中AGEs、RAGEs、MMP-9浓度。AGEs、RAGEs检测选用购自美国RB公司的ELISA试剂盒；MMP-9检测选用上海蓝基生物公司的ELISA试剂盒。操作步骤为：①解冻标本：从-80℃冰箱中取出样本，放置室温解冻。②按照ELISA试剂盒操作：从4℃冰箱中取出试剂盒，放置室温20 min。具体实验操作严格按各说明书进行。③酶标仪（美国，Thermo公司，MK3）测定吸光值。每个样本重复测定2次，取均值。

1.4 胎盘组织中AGEs、RAGEs及MMP-9检测经产妇知情同意，分娩后立即在胎盘中央取2 cm×2 cm×2 cm大小的胎盘组织。用生理盐水漂洗后置入福尔马林溶液中固定，常规低温石蜡包埋，连续切片。取切片，按照免疫组织化学试剂盒说明书进行操作。AGEs、RAGEs、MMP-9免疫组织化学试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。经DAB显色，苏木素复染等操作后，在显微镜下观察并记录阳性样本数目。阳性细胞为细胞膜或细胞浆中出现黄色或棕黄色颗粒。

1.5 数据分析 采用SPSS 13.0软件对数据进行处理，计量资料采用均数±标准差表示，方差齐时，采用t检验，方差不齐时，采用Mann-Whitney U秩和检验；计数资料采用例数（百分比）表示，组间比较采用卡方检验，相关性分析采用pearson分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中AGEs、RAGEs及MMP-9水平变化 与对照组比较，妊娠期高血压组血清AGEs和RAGEs水平较高，MMP-9水平较低，且孕晚期时，两组孕妇的AGEs和MMP-9水平差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，子痫前期组在孕中期及孕晚期，血清AGEs和RAGEs水平升高，MMP-9表达下降，三个指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。子痫前期组与妊娠期高血压组比较，血清AGEs和RAGEs水平较高，MMP-9水平较低，且孕中期和孕晚期时，RAGEs和MMP-9水平差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.2 相关性分析 将孕妇血清中三个指标的数据进行相关性分析得到，MMP-9与AGEs、RAGEs水平间均呈负相关；AGEs与RAGEs水平间呈正相关。AGEs表达水平与RAGEs水平的相关性为r=0.38 （P＜0.05），AGEs表达水平与MMP-9水平的相关性r=0.49 （P＜0.05），RAGEs水平与MMP-9水平的相关性r=0.44 （P＜0.05）。

2.3 胎盘组织中AGEs、RAGEs及MMP-9表达 各组孕妇胎盘组织中MMP-9阳性表达数量：对照组＞妊娠高血压组＞子痫前期组；AGEs和RAGEs阳性表达数量：子痫前期组＞妊娠高血压组＞对照组。与正常对照组相比，子痫前期组中MMP-9表达阳性染色细胞染色明显较弱，AGEs和RAGEs表达阳性染色细胞染色明显增强，且三指标差异有统计学意义（P＜0.05）。子痫前期组与妊娠期高血压组相比，MMP-9表达阳性染色细胞染色较弱，AGEs、RAGEs表达阳性染色细胞染色较强，三指标差异有统计学意义（P＜0.05）。妊娠期高血压组与对照组比较，AGEs、RAGEs及MMP-9阳性染色细胞染色差异无统计学意义（P＞0.05），（表3，图1）。

表1 各组孕妇基本情况（±s）

表1 各组孕妇基本情况（±s）

项目 对照组（n=16）妊娠期高血压组（n=10）子痫前期（n=7）F值 P值孕周 17.2±0.816.9±0.7 16.8±0.70.4510.63年龄（岁） 27.5±3.128.4±2.5 28.1±1.70.1050.911空腹血糖（mmol/L） 4.7±0.44.5±0.4 4.6±0.30.2520.742体质指数（kg/m2） 22.7±4.423.4±4.5 22.9±3.90.2040.811

表2 孕妇血清AGEs、RAGEs、MMP-9的表达水平

表3 AGEs、RAGEs、MMP-9在胎盘滋养细胞中的阳性表达比较（n，%）

图1 胎盘组织中AGEs、RAGEs、MMP-9表达比较

3 讨论

AGEs是脂类、蛋白质与还原单糖发生非糖化反应而形成的混合物。生理条件下，AGEs不能大量形成，在血糖水平较高、肾衰、骨关节炎等情况时，能大量生成。李双喜[9]报道，在糖尿病周围神经病变患者中，AGEs水平明显增高。研究发现，在骨关节炎病变严重程度高的患者中，AGEs水平高于其他人群[10,11]。系统性红斑狼疮、多囊卵巢综合症等患者外周血中AGEs水平也显著升高[12,13]。RAGEs是AGEs研究最深入、作用最明确的受体，存在于内皮细胞、血管平滑肌细胞以及单核巨噬细胞等表面上。RAGEs属于免疫球蛋白超家族成员，具有多种不同的生物效应。一方面，RAGEs参与炎症损伤过程，通过促炎细胞因子的分泌及激活靶基因的表达；另一方面，RAGEs可促进内皮细胞功能失调，通过抑制基质金属蛋白酶等的表达等[14]。本研究中，在孕中期和孕晚期，与对照组比较，妊娠期高血压组和子痫前期组血清AGEs和RAGEs水平均较高。且子痫前期组与对照组比较血清AGEs和RAGEs水平差异有统计学意（P＜0.05）；子痫前期组与妊娠期高血压组相比，血清RAGEs水平显著增高（P＜0.05）。与刘云[15]及李苑等[16]关于子痫前期孕妇血清RAGEs明显增高的报道一致。提示，AGEs-RAGEs的激活可能参与了子痫前期发生。

基质金属蛋白酶（MMP）是滋养细胞层在降解、浸润过程中分泌的一组对血管生成、重建及改造细胞外基质成分起主要作用的蛋白水解酶。MMP-9其中最有效的蛋白水解酶[17]。研究表明，滋养细胞浸润子宫内膜能力下降可能是妊娠期高血压疾病发病的主要相关因素之一[18]。本研究中，与对照组比较，妊娠期高血压组和子痫前期组血清MMP-9水平较低。且子痫前期组与对照组及妊娠期高血压组及比较，孕妇的MMP-9表达显著降低（P＜0.05），提示MMP-9可能是正常妊娠的重要调节因子。正常妊娠孕妇胎盘中滋养细胞的浸润能力较强，利于维持胎儿正常生长发育；子痫前期组滋养细胞的浸润能力下降，可能导致了血管功能异常，使胎盘血流灌注不足，缺血缺氧而引起妊娠期高血压疾病的一系列临床症状[19]。

相关分析显示孕妇外周血中AGEs与RAGEs水平呈正相关，提示AGEs与RAGEs可能对子痫前期有协同作用。MMP-9与AGEs、RAGEs水平呈负相关，说明AGEs与RAGEs受体结合后，通过调控各种炎症因子的表达，减少了MMP-9的生成。免疫组化结果显示，RAGEs在血管内皮细胞和胎盘绒毛合体滋养细胞中都大量表达。血管内皮细胞上的RAGEs与AGEs结合后，能抑制MMP-9的生成，促发氧化应激和血管内炎症损伤反应，改变了血管内皮细胞的形态，血管通透性增加，大量蛋白丢失，使患者血管内皮的病理生理变化。

综上所述，子痫前期孕妇血清和胎盘组织中AGEs和RAGEs水平高表达，MMP-9水平低表达可能是其发病的重要因素之一。因此，对妊娠高血压患者尤其是子痫前期患者进行上述指标的监测及调节意义较大。