HPLC波长切换法同时测定参麦颗粒中6种成分的含量

陶 健，王小龙

0 引言

参麦颗粒收载于中药成方制剂第十三册，由山药、枸杞子、麦冬、红参、南沙参、黄精等6味药材加工而成，具有养阴生津的功效，主要用于面黄肌瘦、津少口渴、腰膝酸软、食欲不振、头晕眼花，心悸气短、神经衰弱等疾病的治疗[1]。中成药复方制剂所含有效成分复杂，中药材质量因产地、采收季节、加工方法等因素的影响，导致中成药复方制剂不同批次间存在较大质量差异，提高中成药复方制剂的质量标准迫在眉睫。近年来多成分质量控制已逐步应用于中成药复方制剂的质量控制中，参麦颗粒现行质量标准未对方中任何成分进行定量研究，也未检索到对本品中任一成分进行定量检测的文献报道，难以有效控制参麦颗粒的质量均一性和疗效一致性。本文采用HPLC波长切换技术，对参麦颗粒中主要成分山药所含主要活性成分尿囊素，枸杞子所含活性成分原儿茶醛、儿茶素和表儿茶素，麦冬所含活性成分麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B进行了同时测定研究，所建立的方法操作便捷、数据准确、重复性好，为参麦颗粒质量标准的提升提供了数据支持。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱系统(美国安捷伦科技公司)；AE200S型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；KQ-50型超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂)。

1.2 试药与试剂 参麦颗粒(规格：每袋装25 g，批号：201711001、201712001、201801003)来源于李时珍医药集团有限公司；尿囊素对照品(111501-200202，含量100.0%)、原儿茶醛对照品(110810-201608，含量99.3%)、儿茶素对照品(110877-201604，含量99.2%)、表儿茶素对照品(110878-200102，含量99.7%)来源于中国食品药品检定研究院；麦冬甲基黄烷酮A对照品(74805-92-8，含量98.0%)和甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品(74805-91-7，含量98.0%)来源于上海纯优生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.5%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，17.0%A；10～16 min，17.0%A→23.0%A；16～31 min，23.0%A→49.0%A；31～42 min，49.0%A→63.0%A；42～50 min，63.0%A→17.0%A)；0～16 min时在224 nm[2-3]波长下检测尿囊素，16～31 min在280 nm[4-5]波长下检测原儿茶醛、儿茶素和表儿茶素，31～50 min时在296 nm[6]波长下检测麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B；体积流量：0.9 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μl；理论塔板数按照所测各色谱峰计均不低于3 500，所测成分尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B均能达到有效分离，分离度>1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B对照品各适量，分置6个量瓶中，用50%甲醇制成尿囊素0.774 mg/ml、原儿茶醛0.258 mg/ml、儿茶素0.146 mg/ml、表儿茶素0.312 mg/ml、麦冬甲基黄烷酮A 0.238 mg/ml、甲基麦冬二氢高异黄酮B 0.172 mg/ml的单成分标准品溶液；依次精密吸取各单成分标准品溶液2.5 ml，置同一50 ml量瓶中，用50%甲醇制成尿囊素38.7 μg/ml、原儿茶醛12.9 μg/ml、儿茶素7.3 μg/ml、表儿茶素15.6 μg/ml、麦冬甲基黄烷酮A 11.9 μg/ml、甲基麦冬二氢高异黄酮B 8.6 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 参麦颗粒供试品溶液 取参麦颗粒适量，研细，取约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，密塞，称定重量，KQ-50型超声波清洗器超声提取30 min，放冷，擦干外壁，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，制成参麦颗粒供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 按照参麦颗粒质量标准项下的处方和制法，分别制备缺山药、缺枸杞子和缺麦冬的3个阴性样品，再按照“2.2.2”项下参麦颗粒供试品溶液制备方法制成山药阴性样品溶液、枸杞子阴性样品溶液和麦冬阴性样品溶液。

2.3 阴性干扰试验 精密吸取混合对照品溶液、参麦颗粒供试品溶液、山药阴性样品溶液、枸杞子阴性样品溶液和麦冬阴性样品溶液各适量，依法进样测定，结果显示，阴性样品对测定无干扰，色谱图见图1。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下单成分标准品溶液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分置于6个20 ml量瓶中，用50%甲醇制成25倍浓度差的6个混合标准溶液，依法进样测定尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积，以所测各成分质量浓度C为横坐标，尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程，结果见表1。

2.5 精密度考察 取“2.2.1”项下的混合标准溶液，依法进样连续测定6次，记录尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积，结果所测各成分尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积的RSD分别为0.77%、1.15%、1.30%、0.91%、1.17%、1.62%。

图1 参麦颗粒HPLC色谱图

注：A.混合标准品(Mixed reference)，B.参麦颗粒样品(Sample of Shenmai granule)，C.山药阴性样品(Sample negative ofdioscoreaerhizoma)，D.枸杞子阴性样品(Sample negative oflyciifructus)，E.麦冬阴性样品(Sample negative ofophiopogonisradix)。1.尿囊素(Allantoin)，2.原儿茶醛(Protocatechuic aldehyde)，3.儿茶素[(+)-catechin]，4.表儿茶素(L-epicatechin)，5.麦冬甲基黄烷酮A(Methylophiopog onanone A)，6.甲基麦冬二氢高异黄酮B(Methylophiopogonanone B)

表1 线性关系实验结果

2.6 重复性考察 取参麦颗粒样品，按照“2.2.2”项下参麦颗粒供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，依法进样测定，记录尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积，计算所测各成分含量，结果尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B含量的RSD分别为1.27%、1.38%、0.79%、1.41%、1.74%、0.88%。

2.7 稳定性考察 取参麦颗粒样品的同一份供试品溶液为考察对象，于室温下0 h、2 h、4 h、6 h、10 h、16 h依法进样测定，记录尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积，结果参麦颗粒供试品溶液室温下16 h内稳定，尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B峰面积的RSD分别为0.83%、1.18%、1.25%、0.97%、1.21%、1.46%。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的参麦颗粒样品适量，研细，取6份，每份约1.5 g，精密称定，分置不同的具塞锥形瓶中，分别精密加入混合标准溶液(尿囊素0.439 mg/ml、原儿茶醛0.136 mg/ml、儿茶素0.083 mg/ml、表儿茶素0.175 mg/ml、麦冬甲基黄烷酮A 0.137 mg/ml、甲基麦冬二氢高异黄酮B 0.092 mg/ml)1.0 ml，再按照“2.2.2”项下参麦颗粒供试品溶液制备方法制备加样回收样品试液，依法进样检测，计算尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的回收率及RSD值，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

3 样品含量测定

取3批参麦颗粒样品(批号：201711001、201712001、201801003)各适量，按照“2.2.2”项下参麦颗粒供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法进样测定，记录所测各成分尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的峰面积，计算所测各成分的含量，结果见表3。

表3 含量测定结果(n=3，μg/g)

4 讨论

4.1 流动相选择的考察 在流动相的选择过程中，笔者首先考察了甲醇-水流动相体系[3]和乙腈-水流动相体系[5-8]，结果显示，乙腈-水流动相体系优于甲醇-水流动相体系，但所测成分原儿茶醛、儿茶素分离效果欠佳，尿囊素色谱峰存在拖尾现象；在此研究基础上，笔者对流动相中水相(0.5%冰醋酸溶液[4]、0.5%磷酸溶液)进行了对比考察，同时采用梯度洗脱技术，对梯度洗脱中流动相的比例进行了不断摸索，最终确定以乙腈-0.5%冰醋酸溶液为流动相，按照文中“2.1”项下的洗脱比例对参麦颗粒中的尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B进行同步测定。结果显示，在此流动相体系条件下，色谱图基线平稳，所测各成分尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B均能达到有效分离。

4.2 参麦颗粒供试品溶液制备方法的考察 笔者首先对比考察了不同提取溶剂(甲醇[6-8]、50%甲醇[4-5]、乙醇、20%乙醇[3])对所测成分尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B提取效率的影响，结果显示，以50%甲醇为提取溶剂时，所测各成分的综合提取效果最佳；在此研究基础上，分别考察了不同提取方式(超声提取[2-3,5-8]、加热回流提取)对所测各成分提取率的影响，同时对提取时间(20 min、30 min、40 min)进行了对比试验，最终选择50%甲醇超声提取30 min作为参麦颗粒供试品溶液的最佳制备方法。

本文所建立的HPLC波长切换法可同时测定参麦颗粒中尿囊素、原儿茶醛、儿茶素、表儿茶素、麦冬甲基黄烷酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B含量，操作简单快速，检测结果准确性高，可以为参麦颗粒的质量控制提供数据支持。