miR-140-5p在骨肉瘤中的表达及其对骨肉瘤细胞侵袭转移的影响

孙玉秀，邱 月，项博文，汪忠淼，秦宝丽

0 引言

骨肉瘤是好发于青少年长骨干骺端的恶性程度极高的原发性骨肿瘤，其发病率占全部青少年恶性肿瘤的2.4%[1-2]。骨肉瘤的生物学特性包括生长迅速、侵袭能力强、远处转移早等，因此，骨肉瘤患者的预后较差，并伴有较高的致死率和致残率[1]。有报道，骨肉瘤的5年生存率极低，约为30%～75%，而且约有80%的患者在临床上被确诊为骨肉瘤时，往往已发生了肺部或其他部位的转移[3-4]。尽管目前外科切除、肿瘤假体置换、化疗放疗等综合治疗改善了部分骨肉瘤患者的生存时间，但总体来看，骨肉瘤患者的平均生存期仍然较短[5-6]。目前，对于骨肉瘤的治疗的总体思路仍主要局限在针对肿瘤整体，通过肿瘤整体切除并辅助化疗的方式，杀死大多数骨肉瘤细胞，但患者的复发率和转移率仍得不到良好的控制。目前，基因疗法为肿瘤治疗提供了新的思路，有针对性地研究骨肉瘤侵袭转移的具体发生机制，找到能够调控骨肉瘤侵袭转移的关键因子并明确其作用机制，从而在基因水平调控骨肉瘤的侵袭转移，具有深远的理论意义和重要的实际价值。

微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一类长度约为20～24 nt的小分子非编码RNA。miRNAs在个体发育、细胞分化、增殖及凋亡等生理活动以及肿瘤发生、发展等病理过程中均具有重要的调控作用[7-8]。既往研究发现，微小RNA140-5p (microRNA-140-5p，miR-140-5p)在神经胶质瘤、胃癌、非小细胞肺癌、膀胱癌等多种肿瘤中表达失常，并与肿瘤的多种生物学行为密切相关[9-11]。目前，关于miR-140-5p在骨肉瘤中的研究不多。本研究探讨miR-140-5p在骨肉瘤组织及细胞中的表达情况，并研究其对骨肉瘤细胞侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞株MG-63及U2OS购自中科院上海细胞库；DMEM培养基购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒及LipofectamineTM3000转染试剂盒购于美国Invitrogen公司；SYBR Master Mixture购自大连Takara公司；特异性miR-140-5p探针由上海吉玛基因公司设计合成；免疫原位杂交试剂盒购于美国BioChain公司；miR-140-5p mimics及NC mimic购于广州锐博公司；Transwell小室购于美国Corning公司；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞株MG-63、U2OS置于DMEM培养基中，人成骨细胞系hFOB1.19细胞置于DMEM/F12培养基中，各培养基均添加10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素。MG-63、U2OS置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中，hFOB1.19置于34 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。待细胞融合率达80%时，以0.25%胰蛋白酶消化并传代。

1.2.2 脂质体介导的细胞转染 取生长状态佳的MG-6、U2OS细胞接种于6孔板中，接种密度2×105个细胞/孔，24 h后，利用脂质体3000分别转染50 nmol/L miR-140-5p mimics和相应的NC mimic，具体操作严格按照转染试剂盒说明书进行。48 h后进行后续实验检测。

1.2.3 qRT-PCR检测miR-140-5p的表达 参照Trizol试剂盒说明书提取组织及细胞的总RNA并分组标记。按照Invitrogen的试剂盒说明书进行逆转录反应，反应产物行PCR扩增，PCR过程按Invitrogen的SYBR Green实时荧光定量PCR 试剂盒说明书在荧光定量仪上进行，设定U6为内参照，引物序列如下：上游，5′-CAGTGGTTTTACCCTATGGTAGG-3′，下游5′-CGTGGTTCTACCCTGTGGTAG-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以miR-140-5p与U6拷贝数的比值为miR-140-5p的相对表达量。

1.2.4 免疫原位杂交检测miR-140-5p表达 采用免疫原位杂交试剂盒检测miR-140-5p表达，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。简要介绍如下：含有0.5% Triton X-100的1×PBS清洗组织切片后，置入采用含有1%封闭液和miR-140-5p特异性探针的杂交液的湿盒中37 °C孵育过夜。次日，依次采用含有4×、2×、1×的0.1% Tween-20的柠檬酸钠缓冲溶液清洗3次，每次5 min。室温下1 × PBS清洗3次，DAPI复染，显微镜下观察。

1.2.5 Transwell实验检测MG-63细胞侵袭转移能力变化 具体步骤参照Transwell小室说明书。常规包被底部膜，水化；同步化各组骨肉瘤细胞，调整计数并接种，上室内加入100 μl含10% 胎牛血清的DMEM培养基；下室内加入500 μl含20% 胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉签擦去Transwell小室内部细胞，冲洗，固定，染色，倒置显微镜下观察并计数。每组铺6个Transwell小室，平均值即细胞侵袭的数量。计算每组6孔的侵袭细胞数。

2 结果

2.1 miR-140-5p在骨肉瘤组织中的表达 收集42例骨肉瘤组织及相应的癌旁组织标本，采用qRT-PCR法检测miR-140-5p的表达情况，结果显示，相比于癌旁组织，miR-140-5p在大部分骨肉瘤组织中表达降低(37/42，88.10%)，见图1A。同时，应用免疫原位杂交的方法检测miR-140-5p在骨肉瘤组织中的表达情况。结果显示，相比于癌旁组织，miR-140-5p在骨肉瘤组织中表达明显降低(P<0.01)，见图1B。

2.2 miR-140-5p在骨肉瘤细胞中的表达 应用qRT-PCR法检测miR-140-5p在人成骨细胞hFOB1.19及人骨肉瘤细胞系MG-63、U2OS中的表达情况，结果显示，相比于人成骨细胞hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤细胞系MG-63及U2OS中的表达明显降低(P<0.01)，见图2。结果提示，miR-140-5p在骨肉瘤中表达降低。

图1 qRT-PCR法及免疫原位杂交法检测miR-140-5p在骨肉瘤组织中的表达

图2 qRT-PCR法检测miR-140-5p在骨肉瘤细胞系中的表达

2.3 转染miR-140-5p mimics可上调MG-63及U2OS细胞内miR-140-5p的表达 通过细胞转染的方式，分别在MG-63及U2OS细胞内转染miR-140-5p mimics以上调其表达水平，并通过qRT-PCR法进行确认。结果显示，与NC mimics组比较，转染miR-140-5p mimics后，MG-63及U2OS细胞内miR-140-5p的表达水平明显升高(P<0.01)，提示转染成功。见图3。

图3 转染miR-140-5p mimics后，miR-140-5p在骨肉瘤

2.4 上调miR-140-5p可抑制骨肉瘤细胞MG-63及U2OS侵袭转移 通过Transwell实验检测上调miR-140-5p对骨肉瘤细胞MG-63及U2OS侵袭转移能力的影响。结果显示，上调miR-140-5p后，MG-63及U2OS细胞的侵袭转移能力明显减弱(P<0.01)。见图4。

图4 上调miR-140-5p可抑制骨肉瘤细胞MG-63、U2OS侵袭转移

3 讨论

非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的一大类RNA，其共同特点是均由基因组上转录而来，但是不具备翻译蛋白的功能，而在RNA水平上能行使各自的生物学功能，参与表观遗传调控[12]。作为目前非编码RNA领域的一个研究热点，miRNAs是在真核生物体内广泛存在的一大类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA[13]。每个独立的miRNA都可以调控若干靶基因，创立一个复杂的基因调节网络[14]。miRNA存在的广泛性和多样性决定了其具有复杂、广泛、多样的生物学功能。研究表明，miRNA在多种肿瘤组织中常异常表达，起到了关键的癌基因或抑癌基因的作用[15]。

MiR-140-5p又称miR-140，位于人染色体16q22.1，全长共含有22个核苷酸，含有1个外显子。既往研究表明，miR-140-5p在多种肿瘤中均发挥了重要作用。Zhang等[16]研究发现，miR-140-5p在结直肠癌组织及细胞系中表达降低，其在结肠癌增殖侵袭转移过程中可作为肿瘤抑制基因。Lan等[17]报道，miR-140-5p在卵巢癌中表达降低，上调其表达水平可抑制卵巢癌细胞的增殖能力并促进凋亡的发生。本研究首先关注了miR-140-5p在骨肉瘤中的表达情况。通过qRT-PCR及免疫原位杂交的方式，结果表明，相比于癌旁组织，miR-140-5p在骨肉瘤组织中表达明显降低。进一步的细胞学水平检测显示，相比于人成骨细胞系hFOB1.19，miR-140-5p在骨肉瘤细胞系MG-63及U2OS中表达同样降低。以上组织学及细胞学水平的检测结果证实，miR-140-5p在骨肉瘤中表达降低，初步提示miR-140-5p可能是骨肉瘤的抑癌基因。

目前，关于miRNAs与肿瘤侵袭转移的研究很多。Jing等[18]在一项下咽鳞状细胞癌的研究中发现，miR-140-5p在下咽鳞状细胞癌中表达减少，上调其表达水平可通过抑制亚当金属肽酶结构域10(ADAM metallopeptidase domain 10，ADAM10)表达的方式抑制FaDu细胞的侵袭转移。Yang等[19]研究显示，miR-140-5p在肝细胞癌组织及6个肝细胞癌细胞系中表达减少，miR-140-5p可通过抑制转化生长因子β (Transforming growth factor β，TGF-β)和促分裂原激活蛋白酶/细胞外信号调节激酶(Mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)的方式抑制肝细胞癌细胞侵袭、转移及增殖。同时，在细胞学水平关注了miR-140-5p对骨肉瘤细胞MG-63及U2OS侵袭转移的影响。本研究首先通过细胞转染的方式，将miR-140-5p mimics转染至MG-63及U2OS细胞中，以构建miR-140-5p过表达的细胞模型，并通过qRT-PCR法确认转染成功；进一步通过Transwell实验，考察不同miR-140-5p表达水平对2种骨肉瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果显示，上调miR-140-5p后，MG-63及U2OS细胞的侵袭转移能力下降。结果表明，miR-140-5p可抑制骨肉瘤细胞MG-63及U2OS细胞的侵袭转移。

骨肉瘤的侵袭转移是一个涉及多通路、多因子、多机制的复杂的生物学行为过程。本研究仅仅初步探讨了miR-140-5p在骨肉瘤细胞的表达及其对骨肉瘤细胞侵袭转移的影响。MiRNAs的下游靶基因众多，调控机制较为复杂，miR-140-5p通过调控哪些与侵袭转移密切相关的靶基因及其参与骨肉瘤侵袭转移的具体机制仍需深入研究。