大黄素甲醚通过调控miR-21表达抑制乳腺癌细胞生存、促进其凋亡

白 洁，英子伟，赵 林，李伟杰，王 聪，谢贤鑫，姜大庆

0 引言

近年来，随着以手术治疗为基础的化疗、放疗及靶向治疗的发展，乳腺癌的复发率及病死率有下降趋势，但是并没有突破性进展[1-3]。靶向治疗及中药单剂的开发是未来乳腺癌综合治疗的重要研究内容。中药大黄中的单剂，如大黄素，对乳腺癌、胃癌及肺癌等肿瘤细胞具有抑制增殖、促进凋亡的作用。大黄素甲醚是大黄的组分之一，其对肝癌及胰腺癌等恶性肿瘤细胞具有杀伤作用[4-5]。miR-21在乳腺癌中为高表达，对乳腺癌细胞增殖具有促进作用，对凋亡具有抑制作用，其作用靶基因包括PDCD4、TPM1及PTEN等[6]。目前还没有大黄素甲醚对乳腺癌细胞增殖及凋亡的作用及机制研究。本研究通过观察大黄素甲醚对乳腺癌细胞的作用，为乳腺癌的中药单剂治疗提供研究基础，为大黄素甲醚在恶性肿瘤中应用的进一步研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株(HCC1937、MCF-7)购自中科院上海细胞库，在中国医科大学肿瘤医院中心实验室培养传代。大黄素甲醚(CAS No：521-61-9)标准品购自成都瑞芬思生物科技有限公司。PDCD4多克隆抗体购自美国Sigma公司。RT-PCR逆转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司，miRNA提取分离试剂盒、All-in-OneTMqPCR Mix试剂盒及MTT试剂盒购购自美国Abcom公司。引物由大连宝生生物技术有限公司进行设计及合成，miR-21 forward：5′-CGTATGTGAGTCTTCAGCTG-3′；reverse：5′-TTTGTCTGAGGGCACAACTC-3′。GAPDH forward：5′-GGAAGTGGGAATCGGAGTC-3′；reverse：5′-GAATAGGGATGTGATGGTTC-3′。试验组为给予大黄素甲醚、miR-21 mimics或miR-21 inhibitor干预的细胞组，对照组为未给予干预细胞组。

1.2 CCK-8法检测转染后细胞增殖 收集培养14 d的乳腺癌细胞按10∶1效靶比混合，加入96孔板，另设靶细胞和单独效应细胞组，每组设5个复孔，放置37 ℃、5%CO2孵箱中培养48 h，每孔加CCK8 10 μl，37 ℃ 孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测OD值，计算大黄素甲醚干预后细胞存活率。

1.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取转染48 h对数期乳腺癌细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染色凋亡检测试剂盒说明书操作步骤进行操作，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，Cell Quest软件进行结果分析，以早期凋亡及晚期凋亡阳性细胞的百分比例之和作为凋亡率进行统计分析，实验重复3次。

1.4 qRT-PCR 取乳腺癌细胞，依照Trizol试剂盒操作说明书进行总RNA提取及纯化，紫外吸收法检测RNA质量。应用变性琼脂糖凝胶电泳方法对RNA完整性进行测定。合成样品cDNA、进行梯度稀释标准品和待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR、进行制备绘制梯度稀释标准曲线DNA模板，实时定量PCR进行待测基因的检测，将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。ΔΔCt法对溶解曲线进行分析。

1.5 Western blot 对乳腺癌细胞株进行预处理后定量蛋白浓度。采用蛋白裂解液裂解蛋白后震荡及摇匀，抽提总蛋白，提取上清液，BCA定量试剂盒定量蛋白浓度。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉于室温条件下封闭90 min后加入一抗，孵育过夜后加入二抗，再次孵育后采用化学发光法显色，β-actin为内参照。采用QuantityOne分析灰度值，结果表示为蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/内参照蛋白灰度值。

1.6 miR-346 mimics或inhibitor转染乳腺癌的细胞 对数生长期乳腺癌细胞消化为单细胞的悬液，以20×104/孔的细胞数接种到24孔板中，依照Lipo2000说明书步骤对融合高于70%的细胞株转染，转染完成后改为含10%胎牛血清培养基继续培养，48 h后以qRT-PCR检测转染效率进行下一步实验。

2 结果

2.1 大黄素甲醚对乳腺癌细胞存活率的作用 CCK-8检测显示，与空白对照组对比，给予不同浓度梯度(0.5、5、50、500 μg/ml)大黄素甲醚培养48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌细胞的细胞存活率均下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A、图1B；经5 μmol/L浓度大黄素甲醚处理的HCC1937及MCF-7乳腺癌细胞在培养48、72、96 h细胞存活率均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1C、图D。

2.2 大黄素甲醚对乳腺癌细胞凋亡的作用 流式细胞术检测显示，与空白对照组对比，分别给予不同浓度梯度(0.5、5、50、500 μg/ml)大黄素甲醚培养48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌细胞凋亡率均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 大黄素甲醚对miR-21调控作用 qRT-PCR检测显示，与空白对照组比较，分别给予5 μg/ml大黄素甲醚干预的HCC1937及MCF-7细胞miR-21表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3A。Western blot检测显示，与空白对照组比较，给予5 μg/ml大黄素甲醚干预的HCC1937、MCF-7细胞PDCD4蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3B。Western blot检测显示，与阴性对照组比较，给予miR-21 mimics干扰的HCC1937、MCF-7细胞PDCD4蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3C。给予miR-21 inhibitor干扰的HCC1937、MCF-7细胞PDCD4蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3D。

3 讨论

在乳腺癌治疗方面，随着靶向药物及化疗的发展，生存期也在延长，但其病死率及复发率并没有得到明显改善[2]。中药单剂抗肿瘤的研发是目前进展期乳腺癌治疗的热点方向。中药单剂具有杀伤肿瘤细胞、减少化疗药物应用剂量及化疗增效作用，并能够减少化疗不良反应[7]。大黄素甲醚是植物大黄中的重要组分之一，作为大黄的复合成分，用于抗炎、导泻及抗肿瘤治疗，在抗肿瘤方面，具有阻断细胞周期、抑制细胞增殖及促进凋亡的作用[8]。微小miR-21在乳腺癌发生发展中发挥重要作用，对乳腺癌细胞的增殖、凋亡及侵袭具有调控作用[9]。有研究显示，大黄素甲醚的靶点包括EMMPRIN、miR370、DNMT等[10]。本研究对大黄素甲醚在乳腺癌细胞中的作用与miR-21的靶向调节机制进行了观察。

图1 CCK-8试验检测

注：A.不同浓度梯度大黄素甲醚培养48 h的HCC1937细胞存活率，B.不同浓度梯度大黄素甲醚培养48 h的MCF-7细胞存活率，C.经5 μmol/L浓度大黄素甲醚处理的HCC1937细胞存活率，D.经5 μmol/L浓度大黄素甲醚处理的MCF-7细胞存活率

图2 流式细胞术检测不同浓度梯度大黄素甲醚培养48 h后HCC1937细胞(A)、MCF-7细胞(B)凋亡率

图3 两组HCC1937、MCF-7细胞miR-21、PDCD4蛋白表达比较

注：A.qRT-PCR检测大黄素甲醚干预的HCC1937、MCF-7细胞miR-21表达；B.Western blot检测大黄素甲醚干预的HCC1937、MCF-7细胞PDCD4蛋白表达；C.Western blot检测给予miR-21 mimics干扰的HCC1937、MCF-7细胞PDCD4蛋白表达；D.Western blot检测给予miR-21 inhibitor干扰的HCC1937、MCF-7细胞PDCD4蛋白表达

本研究结果显示，给予不同浓度梯度大黄素甲醚培养48 h的HCC1937及MCF-7乳腺癌细胞的细胞存活率下降，经大黄素甲醚处理的HCC1937及MCF-7乳腺癌细胞在培养48、72、96 h的细胞存活率均下降。结果表明，大黄素甲醚对乳腺癌细胞具有杀灭作用，并具有剂量、时间依赖性。本研究进一步显示，给予不同浓度梯度大黄素甲醚培养48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌细胞凋亡率均升高，表明大黄素甲醚对乳腺癌细胞凋亡具有促进作用。Hong等[11]研究显示，大黄素甲醚诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞停留在G0/G1期，从而促进其凋亡，抑制其增殖。本研究在HCC1937及MCF-7乳腺癌细胞中得出的结论与其相同。本研究进一步显示，给予大黄素甲醚干预的HCC1937及MCF-7细胞miR-21表达降低，PDCD4蛋白表达升高，表明大黄素甲醚可能对miR-21及PDCD4蛋白表达具有调控作用。给予miR-21 mimics干扰的HCC1937及MCF-7细胞PDCD4蛋白表达降低，而给予miR-21 inhibitor干扰的HCC1937及MCF-7细胞PDCD4蛋白表达升高，表明PDCD4可能是miR-21的靶蛋白，大黄素甲醚通过调控miR-21表达，介导PDCD4蛋白表达，对乳腺癌细胞增殖及凋亡进行调控。Venturutti等[12]研究显示，上调miR-21表达引起PDCD4表达水平降低，PDCD4是miR-21的靶蛋白。Frankel等[13]研究显示，PDCD4是miR-21重要的靶基因，miR-21通过调控PDCD4表达从而介导乳腺癌细胞增殖、凋亡及迁移等恶性行为。Han等[14]研究认为，大黄素甲醚通过调控转录因子SOX2表达抑制直肠癌SW620细胞的转移行为。Chen等[15]研究认为，大黄素甲醚通过下调EMMPPRIN表达诱发结肠癌细胞的凋亡。李燕等[4]研究认为，大黄素通过调节miR-370表达从而对AMPK/SP1/DNMT1信号通路进行调控，诱导肝癌细胞凋亡。以上结果均表明，大黄素甲醚可以对靶基因进行调控，从而介导下游通路的生物学功能，影响肿瘤细胞的增殖及凋亡等恶性行为。

综上所述，大黄素甲醚对乳腺癌细胞具有杀伤作用，这种作用是通过miR-21介导的PDCD4通路实现的，但其作用机制仍有待于进一步研究。