一种利用活性炭提取中药材DNA的方法

卢 雪,陈 蓉,杜 凤,唐 卓*

1中国科学院成都生物研究所 天然产物中心，成都 610041；2中国科学院大学，北京 100049

目前中药材的质量鉴定多用性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别等方法进行，在实际操作中这些方法却有许多不足之处。按照现行的国家药典标准，性状和显微鉴别很难区别相似种，化学法多测定中药材中一种或几种化学成分，但是很多化学成分并不是该中药材所独有，在其常见伪品及其相似种中也存在，因此该方法很难真正对中药材的质量进行控制。在如今的药材市场中，有些不法商家对多种中药尤其是贵重中药材进行掺假[1]，给传统中医的发展带来了极大的挑战。近几年发展起来的中药材DNA分子鉴定的方法，由于其对物种能够快速、准确地识别和鉴定，成为鉴别中药材的重要手段之一[2,3]。

要进行DNA分子鉴定，DNA的提取是极其重要、不可或缺的一个步骤。当前DNA的提取多采用商业试剂盒，但是商业试剂盒价格较贵，步骤多，对于提取大量样品的DNA来说，操作较为繁琐。因此，开发一种简易提取药材中DNA的方法尤为重要。在本文中，我们开发了一种快速、操作简单的DNA提取方法：采用实验室常见易得的NaCl溶液作为裂解液，并在其中加入一定量的活性炭粉末，在高温下进行裂解，直接取裂解液即可作为PCR模板进行检测。

1 实验材料

1.1 材料

藏红花(购自上海崇西西红花种植合作社)；半夏、槐米、三七花、甘草(购自四川御民堂大药房有限责任公司)。

1.2 仪器与试剂

主要仪器：PCR仪(博日，TC-96/G/H(b)c)，实时荧光定量PCR仪(Thermo,5100),凝胶成像分析仪(Typhoon FLA7000)，显微镜(Nikon，Eclipse-E200)，恒温仪(MS-100)，旋涡混合器(其林贝尔，GL-888)，调速迷你离心机(上海生工，Super Mini Dancer)。

主要试剂：150 mmol/L NaCl，400目活性炭粉(天津致远化工试剂有限公司)，引物合成于上海生物工程技术有限公司，SYBR Green I(invitrogen)，裂解液(Extract-N-Amp? Plant PCR Kit,Sigma-Aldrich)，PCR试剂(北京全式金生物技术有限公司)。

2 实验方法

2.1 验证活性炭吸附DNA

用半夏在商业的裂解液(Sigma)中进行裂解，离心取上清，将其平均分为三份，NC不做任何处理，1号在95 ℃金属浴中加热20 min，2号加入100 mg活性炭，并在95 ℃金属浴中加热20 min，12 000 rpm离心3 min。取NC、1、2号上清液作为模板进行PCR。扩增引物为半夏的特异性引物BP：5′-GGGAGACTCCCG ACGATCGCA-3′，BRP:5′-GCCGCACG GACGGATGGAT-3′[4]，反应25 μL体系，包括2.5 μL 10×Taq buffer，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L BP，0.5 μmol/L BRP，2.5 U Taq DNA聚合酶，1 μL 模板，其余用水补齐。扩增条件94 ℃预变性3 min，94 ℃变性温度30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

2.2 促进中药材的裂解

将中药材研磨成细粉，称取10～20 mg粉末至1.5 mL EP管中，阴性对照组加入600 μL 150 mmol/L NaCl作为裂解体系，并加入8 μL的灭菌水，实验组将灭菌水替换为8 μL 100 mg/mL(裂解体系活性炭终浓度为1.33 mg/mL)活性炭(AC)，两组均在漩涡震荡仪上震荡均匀，并将其置于恒温仪上95 ℃震荡处理10 min。取混悬裂解液作为PCR模板。用商业化的裂解液裂解相应的中药材作为阳性对照。扩增中药材用ITS2通用引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，ITS3R:5′-GACGCTT CTCCAGACTACAAT-3′[3]，反应25 μL体系，加2.5 μL 10×Taq buffer，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L ITS2F，0.5 μmol/L ITS3R，2.5 U Taq DNA聚合酶，1 μL 模板，其余用水补齐。在RT-PCR反应中，25 μL体系加入终浓度0.4×的SYBR Green I，其他试剂用量与普通PCR一致，加水至25 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性温度30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，除槐米扩增22个循环，其余均扩增30个循环，最后72 ℃延伸5 min。普通PCR产物在3%的琼脂糖凝胶中进行电泳，RT-PCR经过实时荧光定量曲线，自动设置荧光阈值，得到荧光值对应的Ct值，从而计算出加入AC前后的δCt值。

2.3 显微观察活性炭对细胞裂解的作用

同2.2的裂解处理后，取藏红花裂解后的混悬液于载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下放大160倍观察。

3 实验结果

3.1 验证活性炭吸附DNA

由于AC有较强的吸附作用，所以我们猜想AC在细胞裂解的过程中是否有增加模板量的作用。因此，我们验证了AC是否能吸附DNA。验证材料为半夏裂解液，其特异性引物扩增的条带长度为114bp，如图1所示，扩增条带为目标条带，NC和1号的条带亮度差异不大，所以排除了95 ℃高温对DNA有降解的作用。2号加了AC吸附半夏基因组DNA，对比NC，DNA模板几乎完全被AC吸附了，说明AC有很强的吸附DNA的作用。在裂解液裂解细胞释放DNA的过程中，有部分细胞的结构不会完全被破坏，胞内的DNA就会缠绕在细胞膜表面或者是被阻滞在细胞结构内，导致这部分DNA不能作为PCR模板而用于检测，由于上述结果显示AC有很强的吸附DNA的作用，所以我们推测，在裂解过程中加入AC可以将原本不能释放出来的那部分DNA吸附在其表面，从而能起到增加模板量的作用。

图1 验证AC吸附DNAFig.1 Verifying absorption ability of DNA by AC注：M--DNA marker；以下为PCR产物：NTC--无模板PCR阴性对照；NC--未经任何处理的半夏裂解液；1--半夏裂解液在95 ℃下处理20 min；2--半夏裂解液中加入AC 150 mg，95 ℃处理20 min。Note:M--DNA marker;The following is PCR products:NTC--No template negative control;NC--Without any treatment of Pinellia lysate;1--Pinellia lysate was treated at 95 ℃ for 20 min;2--Adding AC 150 mg in Pinellia lysate,95 ℃ for 20 min.

3.2 促进中药材的裂解

为了进一步证明我们的猜想，我们选用槐米、藏红花和三七花等常用且价格较高的药材作为验证材料，这些药材在市面上容易被掺假。根据图2显示，由于四种中药材均用ITS通用引物ITS2F和ITS3R扩增，植物的条带长度相近，在琼脂糖胶上几乎看不出差异，我们用商业裂解液裂解样品的扩增产物作为阳性对照。同种材料在相同的扩增条件及循环数下，2，5，8，11(在NaCl溶液中加入AC进行裂解)的条带均比对应的1，4，7，10(仅在NaCl溶液中进行裂解)要深。特别是藏红花的条带差异极为显著，10号未扩增出条带，11号条带明显，说明在NaCl中加了AC的裂解效果比只在NaCl中要好。这个结果说明AC确实有增加模板量的作用，我们猜测AC可能将未被释放到NaCl中的DNA吸附在其表面，这部分DNA加入扩增体系中可以进行PCR，从而增加模板量。另外也有可能是AC促进了细胞的破裂，使得DNA释放更充分。

图2 AC促进中药材的裂解Fig.2 AC improved the lysis of traditional herbal medicine注：M--DNA Marker；NTC--PCR阴性对照；1、2、3--槐米；4、5、6--三七花；7、8、9--甘草；10、11、12--藏红花；1、4、7、10仅用NaCl溶液裂解，2、5、8、11用NaCl溶液加AC裂解；3、6、9、12--用商业裂解液裂解(作为阳性对照)。Note:M--DNA Marker;NC--Negative control;1,2,3--sophora flower;4,5,6--Netoginseng flower;7,8,9--Glycyrrhiza;10,11,12--Saffron;1,4,7,10--only lysated with NaCl solution,5-8 Adding AC in the NaCl solution to lysate;3,6,9,12--lysising with commercial Lysate (as positive control).

为了对增加的模板进行定量，我们运用了实时荧光定量PCR仪对在裂解液中加AC与未加的样品的模板量进行了比较。如图3所示，列举了四种常见中药材的实时荧光定量PCR曲线图，在裂解液中加入AC后，Ct值均有显著变化。δCt值的差异反映了PCR的模板量差异，Ct值越大，模板量就越少，相反则模板量越多。Ct值减少1，则表示模板量增加2倍，如图3中槐花、三七花、半夏和藏红花的δCt值分别为2.47、3.91、2.75、4.92，模板量分别增加了5.54、15.03、6.73、30.27倍。其中，藏红花加入AC裂解后模板量增加了30.27倍，这充分证明了AC在裂解过程中促进裂解增加模板量的作用。

3.3 显微观察活性炭对细胞裂解的作用

为了进一步探究AC增加模板量的原因，我们对加入AC与否的裂解液进行了显微观察比较。如图4所示，A图是仅在150 mmol/L NaCl中裂解藏红花，B图是在150 mmol/L NaCl中加入AC一起裂解。将裂解完成后的藏红花裂解液置于显微镜下观察，我们发现A图中，藏红花细胞多聚集、呈完整状态或碎片较大，而在B图中，细胞分散、结构明显多被破坏，碎片相对较小。这个结果没能直接证明我们之前的猜测，但是根据显微观察的结果显示，我们惊奇地发现AC的在细胞的裂解过程中可能有撞击、割裂或者摩擦细胞的机械作用，使得细胞中的DNA能够更好地释放出来，从而增加了被裂解样品的模板量。AC是否会吸附未被充分释放在裂解液中的DNA模板用于下游分析，还有待验证。

4 讨论

近年来，有很多固相提取DNA的材料相继问世，例如用多聚赖氨酸包裹的硅颗粒来提取尿液中的DNA[4]；多聚离子流体涂层提取复杂样本中的DNA[5]；用多层硅热塑性薄片提取高分子量DNA[6]；用庚二亚氨酸二甲酯(DMP)与胺基协同吸附血液及细菌中的DNA和RNA[7]；用壳聚糖修饰的fusion 5滤纸[8]和磁珠[9]吸附样本DNA，可以直接用于下游PCR分析；但是这些材料在制作方面相对复杂，真正产业化可能还需要一些时间，所以找一种已经产业化的材料来提取DNA，老材料新用法可以缩短从试验到应用的时间。经过一番了解与试验，我们探索出了一种利用活性炭提取DNA的方法。活性炭是一种不规则的多孔炭材料，具有较大的比表面积，对气体、色素以及挥发性有机物具有很强的吸附作用，多用于净化空气、水质以及脱色等[10]。活性炭表面有丰富的含氧官能团和含氮官能团，这也就使活性炭有了特殊的化学性能，能通过离子交换作用、静电作用、扩散力、供-受电子交换作用对其他物质进行吸附[11]。在本文中，我们用活性炭来吸附提取DNA，将活性炭的用途扩大到了分子生物学的领域。

图3 用实时荧光PCR验证AC促进中药材的裂解Fig.3 Verifying activated carbon improved the lysis of Chinese herbal medicine with real-time PCR.注：A.槐米；B.三七花；C.甘草；D.藏红花；NTC--PCR阴性对照；NC--仅以NaCl为裂解液；AC--在NaCl中加入终浓度为1.33 mg/mL的AC；CtNC、CtAC为NC和AC的Ct值，δCt值为CtNC和CtAC之差。Note:A.sophora flower;B.Netoginseng flower;C.liquorice;D.saffron;NTC--No template control;NC--only lysated with NaCl solution；AC--Adding final concentration of AC is 1.33 mg/mL;CtNC,CtAC is the Ct value of NC and AC,and the δCt is the difference between CtNC and CtAC.

图4 显微观察AC对细胞裂解的作用Fig.4 Microscopic observation of the effect of activated carbon on cell lysis.注：A.藏红花在150 mmol/L NaCl中裂解。B.藏红花在含终浓度1.33 mg/mL的AC的150 mmol/L NaCl中裂解Note:A.The saffron was lysated in 150 mmol/L NaCl solution.B.The saffron was lysated in 150 mmol/L NaCl solution with AC of final concentration is 1.33 mg/mL.

我们开发的这种DNA提取方法采用NaCl溶液作为裂解液，简单易得且经济实惠。在其中加入一定量的AC，AC本身不会影响PCR，所以可以直接取包含AC的混悬裂解液作为模板用于PCR等下游分析检测。在探究AC增加模板量的原因时，我们通过显微观察结果证明，AC确实能够通过机械作用在裂解过程中破坏细胞，释放出更多的DNA。但是AC是否可以将未被完全释放的DNA吸附在其表面，还需要在以后实验中进一步验证。

目前商业的试剂盒价格都在几百上千不等，并且操作繁琐，需要多次离心、洗脱等步骤，裂解时间也较长，对于大样本量的DNA提取是耗时且极为不方便的。而我们开发的这种简易提取DNA的方法轻松地解决了这个问题，仅需要NaCl溶液和AC粉末，即可快速提取DNA。这种简单快速的DNA提取方法可以应用到中药材的DNA提取中，适合大量样本的DNA提取，为实际操作带来了极大的便利。同时，AC对DNA吸附与解吸也是一个重要的研究方向，基于AC极强的吸附能力，如果能够找到AC的解吸剂，那么就可以开发出一种提取DNA及分离纯化DNA的新方法，这在DNA提取领域将是一个新的突破。