代谢组学解析遮阴对茶叶主要品质成分的影响

陈勤操，戴伟东，蔺志远，解东超，吕美玲，林智

（1中国农业科学院茶叶研究所/农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，杭州 310008；2中国农业科学院研究生院，北京 100081；3安捷伦科技（中国）有限公司，北京 100102）

0 引言

【研究意义】茶因其迷人的风味及出色的保健功效而日益受到人们喜爱。滋味作为影响茶叶感官品质的一个重要因素，很大程度上决定了消费者对茶叶的选择。茶叶的滋味主要由茶多酚、咖啡碱、氨基酸、黄酮（醇）及其糖苷、可溶性糖等呈味成分决定[1]，而这些呈味成分的合成与积累又显著受茶园环境条件和管理措施的影响。高温和强光照被认为是造成茶叶苦涩味较重的重要因子[2-3]，因此，生产上常利用遮阴处理来改善茶园环境，提高茶叶品质。详细研究遮阴与茶叶代谢和品质成分的关系，可以更好地在生产实践中利用遮阴来改善茶叶品质。【前人研究进展】目前已有诸多遮阴改变茶园环境、茶叶代谢与品质成分的报道。研究表明，遮阴可以降低树冠面温度、光强，提高空气相对湿度[4]；降低地面和土壤温度，提高土壤水分含量[5]；显著降低树冠层的日极端最高温度、温度日较差和相对湿度日较差[3]。遮阴后的茶叶，普遍出现总多酚含量降低，氨基酸含量升高，酚氨比下降[2-3,6]；儿茶素品质指数增加[2,4]；咖啡碱含量升高[7-9]；黄酮（醇）及其糖苷含量下降[10-11]；叶绿素含量增加[7,12]；粗纤维含量降低[3,13]；可溶性糖含量增加[13]；氮磷钾等养分含量增加[4]。此外，遮阴对茶叶的香气成分也有明显的影响[14-16]。目前，代谢组学已广泛应用于植物生理代谢、食品加工等领域。本课题组前期已建立了良好的茶叶代谢组学研究平台，并已广泛应用于茶叶滋味成分鉴定[17]、茶叶生理代谢[18]、茶叶加工[19-20]等方面的研究中。【本研究切入点】目前的研究主要聚焦在30%—95%的遮阴水平对茶叶代谢与品质成分的影响，对于黑暗遮阴对茶叶代谢与品质成分的影响则尚无详细的研究报道。此外，受检测技术的限制，以上研究主要集中在常规成分（如儿茶素类、咖啡因、氨基酸、没食子酸等）上，导致许多对滋味有重要作用的化合物被遗漏，如儿茶素聚合物、核苷（酸）等[17]。代谢组学方法以生物体内代谢组为研究对象，具有高效、全面及准确的特点。【拟解决的关键问题】本研究对茶树进行中度遮阴（65.0%）和黑暗遮阴（99.7%）处理，同时采用UHPLC-Q-TOF/MS对遮阴后茶叶中主要品质成分进行分析，以期更加详细地了解遮阴与茶叶品质的关系。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

代谢组学分析：超高效液相色谱（Infinity 1290，Agilent Tech，美国）串联四级杆飞行时间质谱（Q-TOF 6540，Agilent Tech，美国）；儿茶素、没食子酸与咖啡碱检测：超高效液相色谱系统（Acquity H-Class，Waters，美国）；紫外分光光度计为 UV-3600（Shimadzu，日本），光量子仪为LI-190SA（Lincoln，美国）。

LC-MS级甲醇购于美国Merck公司；福林酚购于麦克林公司；没食子酸一水结合物购自阿拉丁公司；分析纯茚三酮购于Kermel公司；AlCl3购自上海美兴化工股份有限公司；芦丁购自百灵威公司；儿茶素与咖啡碱标准品购自Sigma-Aldrich公司；甲酸（>99.0%）购于日本TIC公司；试验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 样品处理

遮阴处理：试验茶园（北纬 30°10′52″，东经120°5′26″），品种为‘龙井 43’，遮阴时期为 2018年5月19—28日，共10天，主要为阴雨、多云天气。遮阴处理如图1-A所示，采用黑色遮阳网，设遮光率为65.0%（中度遮阴组，M组）和99.7%（黑暗遮阴组，D组）两组处理，不遮阴作为对照（CK组）。遮阴结束后，采摘一芽二叶，放入液氮中冷冻，然后-50℃冻干36 h，磨碎后放入-20℃冰箱中保存备用。

茶汤提取：考虑到主要是考察遮阴对茶叶品质成分（即茶叶中可用水冲泡出的成分为主）的影响，同时为防止多酚类物质在高温提取过程中被大量氧化，所以茶汤制备参照YANG等[17]方法并进行稍许改动：准确称取0.1 g茶样放入EP管中，加入15 mL超纯水，放入100℃水中浸提10 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液用于后续分析。进超高效液相色谱系统分析前，上清液用0.22 µm滤膜过滤。

1.3 检测方法

1.3.1 茶多酚、氨基酸、总黄酮测定 总多酚含量测定参照国标《GB/T 8313—2013》进行：先将上述茶汤稀释20倍，然后于10 mL刻度试管内加入1.0 mL稀释后的茶汤和5.0 mL 10%的福林酚溶液，摇匀后反应5 min，然后加入4.0 mL 7.5%的NaCO3溶液，加水定容至10 mL，摇匀后放置60 min。最后用10 mm比色皿在765 nm波长下测定吸光度。

总氨基酸含量测定参照国标《GB/T 8314—2013》进行：吸取1 mL茶汤注入25 mL比色管中，加入0.5 mL pH 8.0磷酸盐缓冲液和0.5 mL 2%的茚三酮溶液，然后在沸水中加热15 min，待冷却到室温后定容至25 mL，放置10 min后用5 mm比色皿于570 nm波长下检测吸光度。

总黄酮含量测定采用三氯化铝法：吸取1 mL茶汤注入25 mL比色管中，加入1 mL 10% AlCl3溶液，4 mL pH 5.5的乙酸钠溶液，定容至25 mL，反应30 min，然后于415 nm波长下用10 mm比色皿测定吸光度。

1.3.2 儿茶素类、没食子酸、咖啡碱测定 参照YANG等[17]的方法进行：色谱柱为BEH C18 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，Manchester，UK），柱温为35℃。流动相：A相为0.1%的甲酸溶液，B相为纯甲醇。洗脱程序为：0 min，3% B相；3 min，8% B 相；7.5 min，20% B 相；11 min，20% B 相；13 min，60% B相；14.5 min，60% B相；15 min，3% B相；19 min，3% B相。流速为 0.35 mL·min-1，进样量为 5 μL。

1.3.3 代谢组学分析 采用UHPLC-Q-TOF/MS进行测定，色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×3.0 mm，1.8 μm，安捷伦公司，美国）。主要参数如下：色谱条件流动相A相为0.1%甲酸-水，B相为甲醇；进样量为3 μL；流速为0.4 mL·min-1；柱温为40℃；流动相线性梯度洗脱为：0 min，10% B相；4 min，15% B 相；7 min，25% B 相；9 min，32% B 相；16 min，40% B相；22 min，55% B相；28 min，95% B相；30 min，95% B相；柱后平衡时间为5 min。质谱采用电喷雾离子化（ESI）模式，扫描方式为正离子模式；毛细管电压为 3 500 V；干燥气温度和流速分别为300℃和8 L/min；雾化气压强为35 psi；鞘气温度和流速分别为300℃和11 L·min-1；质谱扫描范围，质荷比（m/z）为100—1 000。

1.4 数据处理

UHPLC-Q-TOF/MS分析获得的原始图谱分别采用 DA Reprocessor software（Agilent Tech.，Santa Clara，CA）和 Mass Profiler Professional 13.0软件（Agilent Tech.，Santa Clara，美国）进行峰匹配和积分。主成分分析（PCA）使用Simca-P 11.5软件。Tukey s-b（K）检验使用PASWstat software（版本18.0，美国）软件。

2 结果

2.1 遮阴对茶叶外观表型及含水率的影响

遮阴后（图1-A），茶叶的外观表型变化如图1-B—D所示。与对照相比，黑暗遮阴处理的茶叶颜色明显更深更绿，这是因为适当遮阴可以增加茶叶的叶绿素含量[7,12]，以让茶叶在弱光照条件下捕获更多的光子，增强光合作用。然而，与中度遮阴处理的茶叶颜色变深变绿不同，黑暗遮阴处理的茶叶颜色明显变浅，这与CHEN等[21]的结果相一致。由此可知，适当遮阴可以增加茶叶叶绿素含量，但黑暗遮阴反而会导致叶绿素被分解。另外，遮阴后，茶叶的含水率出现显著增加（表 1），这应该为遮阴后茶园的温度降低，空气湿度增加，茶叶嫩度增加所致。

2.2 遮阴对茶叶多酚、氨基酸、黄酮总含量的影响

图1 茶叶遮阴处理(A)及其外观表型变化(B—D)Fig. 1 Shading treatment (A) and appearance changes of tea leaves (B-D)

表1 遮阴对茶叶中主要生化成分及含水率的影响Table 1 The effects of shading on main biochemical compositions and moisture content of tea leaves

一般而言，遮阴后茶叶的多酚含量会降低，氨基酸含量会上升，从而促使酚氨比下降，提升茶叶的品质[2-4,9,11]。然而，本研究的结果却不尽一样。如表 1所示，总多酚含量在中度遮阴处理后没有显著变化，然而在黑暗遮阴处理后则出现显著增加。与对照相比，总氨基酸含量在中度遮阴和高度遮阴后均显著下降，其中黑暗遮阴处理的含量稍高于中度遮阴处理；不管是中度遮阴还是黑暗遮阴处理，总黄酮含量与对照相比均显著下降；酚氨比作为评价茶叶品质的重要指标之一，其在黑暗遮阴处理后显著上升，预示高度遮阴可能不利于提高茶叶的品质。

2.3 遮阴对茶叶代谢物的影响

为了更加详细地了解遮阴对茶叶代谢与品质成分的影响，对3组处理茶叶的代谢物进行了UHPLC-QTOF/MS分析。经过峰提取和匹配后，共得到 3 236个化合物特征离子，其中2 044个在QC样品中RSD＜30%的特征离子用于下一步分析。PCA分析显示3组样品之间被明显的区分开来，表明遮阴后茶叶的代谢物发生了明显的变化（图2）。

结合笔者课题组前期在代谢组学分析和化合物鉴定方面的工作[17-20]，本次总鉴定出87个化合物，包括2个生物碱、18个氨基酸、12个儿茶素类物质、8个儿茶素二聚体类物质、19个黄酮（醇）糖苷、5个香气糖苷、6个核苷（酸）、9个酚酸、8个其他化合物，其中 82个化合物在遮阴后出现显著差异（P＜0.05）（表 2）。此外，由于 EGCG、咖啡碱在本次LC-MS分析时因含量过高而发生信号过载，以及没食子酸在这次正离子模式下难以被检测，本研究进一步对儿茶素类物质、咖啡碱、没食子酸进行了绝对定量，结果如表1所示。

表2 茶叶中鉴定到的化合物及其相对含量（峰面积，counts）Table 2 Identified compounds and their relative contents in tea leaves (peak area, counts)

续表2 Continued table 2

续表2 Continued table 2

2.3.1 遮阴对氨基酸（amino acids）的影响 氨基酸被认为是茶汤鲜爽味的重要贡献者，但有报道显示只有茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺才呈鲜味，其他氨基酸则呈苦味或甜味[22]。如表2所示，所有鉴定到的氨基酸均表现为极显著差异，但是变化趋势不尽相同。其中组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、色氨酸的含量随遮阴出现显著上升；赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、哌啶酸、缬氨酸、焦谷氨酸、络氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸的含量随遮阴出现显著下降；茶氨酸和亮氨酸的含量在中度遮阴处理后下降，在黑暗遮阴处理后上升。

图2 3组样品的主成分分析得分图（R2X=0.757, Q2=0.687）Fig. 2 PCA score plot of 3 sets of samples (R2X=0.757, Q2=0.687)

2.3.2 遮阴对儿茶素类（catechins）及儿茶素二聚体类（dimeric catechins）物质的影响 儿茶素类物质被认为是茶叶中最重要的类黄酮物质，含量上以表儿茶素为主。其在一系列酶的作用下，可以聚合生成原花青素、聚酯型儿茶素等儿茶素二聚体类物质。如表1和表2所示，与对照相比，中度遮阴处理后，非酯型儿茶素（没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素）和甲基化儿茶素（表没食子儿茶素-3-(3-O-甲基)没食子酸酯、表没食子儿茶素-3- (4-O-甲基)没食子酸酯）的含量出现显著下降，其他儿茶素没有出现显著差异；黑暗遮阴处理后，大部分儿茶素类物质（表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素-3,5-二没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素-3-(3-O-甲基)没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表阿夫儿茶精-3-没食子酸酯）含量都出现显著上升，没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表阿夫儿茶精、表没食子儿茶素-3-(4-O-甲基)没食子酸酯的含量出现显著降低，儿茶素和表儿茶素的含量没有显著变化，但相对中度遮阴处理显著上升。对儿茶素二聚体类物质来说，中度遮阴处理后，只有原花青素 B2出现显著降低，其他没有显著变化；黑暗遮阴处理后，除聚酯型儿茶素B外，所有儿茶素二聚体类物质都出现显著上升。大部分儿茶素类物质及其二聚体含量的上升，解释了为什么黑暗遮阴处理后茶叶多酚总量会上升。儿茶素类，尤其酯型儿茶素被认为是茶叶中最重要的苦涩味物质；此外，新近研究表明原花青素、聚酯型儿茶素类物质与白茶的苦涩味呈正相关[17]。因此，儿茶素类、原花青素类、聚酯型儿茶素类物质含量的上升可能会增强黑暗遮阴处理组茶叶的苦涩味，导致茶叶品质下降。

2.3.3 遮阴对黄酮（醇）糖苷（flavone glycosides and flavonol glycosides）的影响 如表2所示，本次研究中主要检测到由芹菜素、槲皮素、山奈酚、杨梅酮生成的黄酮（醇）糖苷。中度遮阴处理后，大部分黄酮（醇）糖苷含量都出现了显著下降；黑暗遮阴处理后，几乎所有黄酮（醇）糖苷在中度遮阴处理组基础上，其含量出现进一步降低，但槲皮素二葡萄糖苷的含量显著上升，这与 WANG等[10]的研究结果一致。黄酮（醇）糖苷一般认为是绿茶的重要呈色物质，有研究显示黄酮（醇）糖苷具有涩味，是红茶、绿茶的主要涩味成分[22-23]，可以增强茶汤的苦涩口感[24]，其含量的下降或许可以在一定程度上降低茶汤的苦涩味。

2.3.4 遮阴对香气糖苷（glycosidically bound volatiles）的影响 茶叶中挥发性成分除以游离的形式存在外，某些醇类香气，如顺-3-己烯醇、苯甲/乙醇、芳樟醇等也可以和樱草糖、葡萄糖等结合生成香气糖苷，作为香气前体物质而存在于茶叶中[25]。中度遮阴处理后，5个香气糖苷的含量都出现了显著上升；黑暗遮阴处理后，除芳樟醇氧化物樱草糖苷的含量显著降低外，其他4个香气糖苷的含量在中度遮阴处理的基础上进一步显著上升（表 2）。近期研究表明，香气糖苷对红茶、白茶的香气形成具有重要贡献[26-27]。因此，香气糖苷含量的上升，可能有利于在茶叶加工过程中，水解释放更多的香气，改善茶叶的香气品质。因此，遮阴处理改善茶叶的香气品质除了增加香气总量和丰富香气种类外[14-16]，还可能通过提高茶叶中香气前体物质含量来实现。

2.3.5 遮阴对酚酸（phenolic acids）的影响 有研究指出酚酸对茶叶的涩味和鲜味有重要影响，如KANEKO等[28,29]的研究表明茶没食子素本身呈涩味，但是在滋味重组试验中，茶没食子素能极显著的增强日本抹茶的鲜味。如表1和表2所示，中度遮阴处理后，没食子酸、茶没食子素、绿原酸、二没食子酰葡萄糖苷的含量显著上升，咖啡酰莽草酸的含量显著降低，其他没有显著变化；黑暗遮阴处理后，没食子酸、茶没食子素等大部分酚酸的含量显著上升，而咖啡酰莽草酸、鲁米诺酸、3-O-p-香豆酰奎宁酸的含量显著降低。酚酸与儿茶素类、黄酮（醇）糖苷等同属于类黄酮代谢途径，它们不同的变化趋势预示遮阴对类黄酮代谢途径的下游分支起着差异性调控。

2.3.6 遮阴对生物碱（alkaloids）和核苷（酸）（nucleosides and nucleotides）的影响 生物碱（咖啡碱、可可碱）是茶叶苦味的重要贡献者，其含量随着遮阴程度的增强而上升（表1和表2）。最近有报道认为核苷（酸）对茶叶滋味有一定的影响[17]，并具有诸多保健功效[30]，但遮阴显著降低了腺嘌呤核苷二磷酸、腺嘌呤核苷磷酸、腺苷、鸟苷在鲜叶中的含量（表2），与YANG等[14]的研究结果相一致。核苷（酸）类物质是能量供应、RNA合成的重要前体，其含量的降低，或许是因为遮阴后光合作用减弱，导致整体代谢减弱所致。

此外，胆碱磷酸、1-乙基-5-羟基-2-吡咯烷酮的含量在中度遮阴后出现显著上升，而甘油磷酸胆碱、N-乳酰乙醇胺、茶氨酸糖苷、泛酸的含量在遮阴后出现显著下降，二氢猕猴桃内酯的含量在中度遮阴处理后显著上升，而在黑暗遮阴处理后则显著下降（表2）。

3 讨论

3.1 叶绿体与游离氨基酸含量存在着紧密的联系

研究发现中度遮阴处理可以加深茶叶的颜色，让茶叶更绿，而黑暗遮阴处理则会导致茶叶绿色变浅，这与前人的研究结果一致[7,21]。一般来说，遮阴后茶叶的氨基酸含量会上升，但本研究中，中度遮阴处理反而降低了总氨基酸含量，黑暗遮阴处理使总氨基酸含量有所回升。氨基酸含量的上升有氨基酸生物合成加强和蛋白质水解增加两条途径。CHEN等[21]研究发现，遮阴（黑暗）处理后，游离氨基酸含量上升并非是由于氨基酸合成的增强，而是由于叶绿体蛋白的水解。在特异性茶树品种‘安吉白茶’叶片白化时期，叶绿素含量降低，氨基酸含量上升，返绿后则出现相反变化[31]；进一步研究显示，在白化时期，与光合磷酸化及叶绿体发育相关基因的表达发生显著下调，而返绿后相关基因的表达又显著上调[32]。此外，‘黄金芽’茶树在遮阴后，叶片变绿，叶绿素含量上升，氨基酸含量降低，自然生长时则表现出相反的趋势[33-34]。这些研究表明，叶绿体蛋白与游离氨基酸含量存在着此消彼长的关系。本研究中，中度遮阴处理后氨基酸含量的降低，很可能是因为其被利用合成了叶绿体蛋白，以结合更多的叶绿素，让茶叶在低光照条件下提高光合效率；而黑暗遮阴处理后，茶树叶片接收到的光强度剧烈降低，导致茶树生物体所需的叶绿素量随之下降，从而导致叶绿体中蛋白质降解，促使游离氨基酸含量相较于中度遮阴处理有所回升。

3.2 遮阴对茶叶碳氮代谢具有双向性

本研究中，遮阴并没有提高总氨基酸的含量，黑暗遮阴处理后总多酚含量反而出现了显著上升。一般来说，遮阴会降低总多酚的含量，提升总氨基酸的含量。然而，也有少量研究与此相反。有研究显示遮阴覆盖会导致春茶的总多酚、粗纤维等的含量上升，总氨基酸含量的下降，而夏秋茶则表现出相反的结果[35]。在春茶采摘末期（4月26日至5月24日），40%遮光率+2.5 m遮荫高度处理使茶叶总多酚含量和酚氨比上升，总氨基酸含量降低，导致茶汤浓厚、苦涩味加重[36]。在春季进行遮阴处理，会增强碳代谢的强度，相对削弱氮代谢的强度[37]，这可能是因为春季温度不高、光照不强，遮阴导致光合作用强度不够所致。本次研究中，总多酚含量的显著上升，很大程度是由表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）含量的上升导致（表 1），LEE等[7]和李明等[38]也发现遮阴导致表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）含量的显著增加。这些结果说明，遮阴对茶叶的碳氮代谢调控具有双向性。光照与温度有利于茶叶多酚的积累，而不利于氨基酸的积累。在夏秋季节，适当的遮阴会逆转高温、强光的作用，从而促使碳代谢向氮代谢转变，降低酚氨比。本遮阴试验中，因为遮阴时段为春季末期，且主要为阴雨、多云天气，光照不强，温度也不是很高，所以遮阴后，特别是黑暗遮阴后，会导致光照严重不足，从而相对加强茶树的碳代谢，降低氮代谢，导致多酚含量显著升高，氨基酸含量显著降低。遮阴后，多酚含量上升，氨基酸含量下降的具体机制仍有待解析。

3.3 基于LC-MS的代谢组学方法具有强大的优势

在本研究中，采用基于 LC-MS的代谢组学方法除了检测到儿茶素类、氨基酸、生物碱等常规成分外，还鉴定到了一些常规分析方法难以检测到的物质，如氨基酸中的哌啶酸、焦谷氨酸；核苷（酸）；儿茶素二聚体类；香气糖苷等物质。这些物质均对茶叶品质具有重要影响，如有报道显示焦谷氨酸对茶汤的鲜味具有重要作用[11]。因此，采用代谢组学技术研究遮阴对茶叶代谢的影响，可以更加全面地了解茶树对光照调控的代谢应答和代谢产物的变化规律，以及遮阴对茶叶品质的影响。

4 结论

本文研究了遮阴对茶叶代谢及主要品质成分的影响，发现中度、黑暗遮阴降低了总氨基酸、黄酮含量，而黑暗遮阴增加了总多酚含量及酚氨比。此外，采用UHPLC-Q-TOF/MS详细研究了遮阴对茶叶代谢的作用，总计鉴定得到了87个化合物，主要为氨基酸、儿茶素类及其二聚物、黄酮（醇）糖苷、香气糖苷、酚酸等，其中82个化合物在遮阴后出现显著性变化。遮阴对茶树叶片的代谢调控是一个复杂的过程，对碳氮代谢具有双向性，适当的遮阴可以提高茶叶品质，但黑暗遮阴则可能不利于提高茶叶的品质。

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