血管紧张素(1-7)通过上调自噬水平缓解肝细胞功能障碍

贺娟，丁见，王馨珂，燕群，赖秋华，李爱民，刘思德

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)在全球及国内发病率均逐年上升[1-2]，肝细胞内脂肪沉积是NAFLD形成的初始形式[3]，并可进一步诱发肝细胞内氧化应激、炎症因子的活化，致使细胞内失衡及损伤[4-5]。肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在肝脏组织中也存在，并可参与NAFLD疾病进程[6-8]。RAS系统包含经典的血管紧张素转换酶-血管紧张素Ⅱ-血管紧张素Ⅱ 1型受体(ACE-AngⅡ-AT1-R)轴及新近发现的血管紧张素转换酶2-血管紧张素(1-7)-血管紧张素(1-7)受体(ACE2-Ang(1-7)-Mas轴)，ACE2-Ang(1-7)-Mas轴被认为是ACE-AngⅡ-AT1-R轴的内在反馈调节轴。AngⅡ可加重肝细胞脂质沉积及细胞损伤[9]，可促进NAFLD进展[10]；Ang(1-7)对肝细胞的作用目前研究尚少[11]。本研究选用人正常肝细胞L-02细胞系，建立脂肪累积模型，研究Ang(1-7)对肝细胞脂质累积及损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常肝细胞L-02细胞系购自ATCC； DMEM细胞培养基、血清购自Gibco；棕榈酸、油酸 、Ang(1-7)、DCFH-DA探针购自Sigma-Aldrich；DHE探针购自碧云天；LC3B抗体购自Cell Signaling Technology；GAPDH抗体购自Proteintech；自噬双标腺病毒(mRFP- GFP-virus)购自汉恒生物。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

细胞以10% FBS完全培养基置于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养。定期进行换液，培养至所需细胞浓度进行相应药物处理。

1.2.2 药物配置

游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)以棕榈酸∶油酸=1∶2浓度配置。步骤如下：①10.1 mg 油酸钠, 4.6 mg棕榈酸钠加入6 mL双蒸水，70 ℃水浴15～20 min；②1.1 g脱脂BSA 加入5 mL 双蒸水，37 ℃水浴溶解；③将脂肪酸溶液与39 mL DMEM混匀，再加入BSA溶液。即50 mL 1 mmol/L的FFA溶液，过滤后用于细胞。作用于细胞时配置成0.5 mmol/L FFA溶液。

1.2.3 分组及处理

分组：①正常对照组(Control)： 以正常培养基进行培养；②FFA组：0.5 mmol/L游离脂肪酸干预24 h；③ FFA+Ang(1-7)10-9mol/L组：0.5 mmol/L游离脂肪酸与10-9mol/L Ang(1-7)共同干预24 h； ④FFA+Ang(1-7)10-7mol/L组：0.5 mmol/L游离脂肪酸与10-7mol/L Ang(1-7)共同干预24 h；⑤FFA+Ang(1-7)10-5mol/L组：0.5 mmol/L游离脂肪酸与10-9mol/L Ang(1-7)共同干预24 h；将细胞接种到6孔板(1×106个/孔)，待细胞贴壁后按照分组依次进行相应刺激，并进行后续处理。

1.2.4 油红染色

将细胞接种到24孔板，爬片上予以药物刺激；将爬片放于配好的油红O染液中，静置30 min后用自来水清洗。爬片放于苏木素染液中，静置40 s后用自来水清洗，返蓝1 min。甘油明胶封片，正置显微镜下观察并拍照。

1.2.5 细胞氧化应激ROS测定

将细胞种植于96孔板中，设置复孔，予药物刺激后，弃上清，以PBS清洗3次；预先用DMEM 以1∶1 000稀释DCFH-DA及DHE探针，以每孔200 μL加入相应探针，37 ℃孵育 30 min；弃去探针，PBS清洗3次，荧光显微镜下拍照观察。

1.2.6 自噬双标病毒转染及荧光染色

将细胞接种在24孔板爬片上，细胞密度为 40%～50%时更换为无血清培养基，转染mRFP-GFP-LC3病毒(MOI=50)，2 h后更换完全培养基，并加入药物刺激，多聚甲醛固定10 min后封片，荧光显微镜下拍照观察，拍照计数并统计。

1.3 统计学分析

结果以Mean±SEM表示，采用Graphpad Prism 5进行方差分析，组间比较采用非配对T检验进行差异分析，并将P<0.05作为有统计学意义的指标。

2 结果

2.1 Ang(1-7)可缓解FFA诱导的肝细胞脂质沉积

0.5 mmol/L FFA可明显增加人正常肝细胞L-02内脂质沉积水平，且在L-02细胞中脂滴更为明显。以三个不同浓度Ang(1-7)与FFA共同作用于肝细胞，结果提示Ang(1-7)能明显缓解FFA诱导的肝细胞内脂质沉积水平，且随着Ang(1-7)浓度的增加缓解脂质水平的能力增强。10-7mmol/L及10-5mmol/L可大幅缓解脂质沉积，其中10-5mmol/L基本可以逆转FFA所致的脂肪累积至正常肝细胞内脂质水平，见图1。

2.2 Ang(1-7)可缓解FFA诱导的肝细胞内的氧化应激

2.3 Ang(1-7)可上调肝细胞内自噬水平，调节脂类代谢

本研究采用自噬双标腺病毒mRFP-GFP-virus转染L-02细胞后观察自噬小体及自噬溶酶体形成的自噬流，结果显示：FFA诱导的脂质沉积的肝细胞内自噬水平相较正常肝细胞内略有上升(自噬溶酶体(红)P=0.047 4, 自噬小体(黄)P=0.013 2)。而相较FFA组，Ang(1-7)则可明显激活上调肝细胞内自噬小体及自噬溶酶体水平。其中，10-9mol/L Ang(1-7)即可轻度上调自噬小体(P=0.000 6)，并显著上调溶酶体水平(P=0.024 1)，10-7mol/L Ang(1-7)与10-5mol/L Ang(1-7)可显著上调自噬小体(10-7mol/L，P<0.000 1；10-5mol/L，P<0.000 1)，及自噬溶酶体(10-7mol/L，P=0.007 5；10-5mol/L，P=0.002 9)，见图4。

图2 Ang(1-7)对FFA诱导的肝细胞内ROS的影响。DCFH-DA探针染色肝细胞，并于荧光显微镜下拍照观察，×200倍

图3 Ang(1-7)对FFA诱导的肝细胞内水平的影响。DHE探针染色肝细胞，并于荧光显微镜下拍照观察，×200倍

A为自噬小体及自噬溶酶体荧光图，红色为自噬溶酶体，黄色为自噬小体。B、C为细胞内自噬小体及自噬溶酶体数目统计分析。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

3 讨论

NAFLD病理学表现为细胞内脂质沉积，肝细胞是NAFLD进展过程中最关键也是受损最严重的细胞[12]。肝细胞内大量脂质沉积诱发氧化应激，后者可致使肝细胞损伤甚至坏死[13]。ACE2-Ang(1-7)-Mas轴是对ACE-AngⅡ-AT1-R内在反馈机制，Ang(1-7)是其主要活性成分，由ACE2水解AngⅡ及AngI生成，可结合特异性受体Mas，拮抗AngⅡ作用[8]。本课题组前期实验证实AngⅡ可加重肝细胞的脂质沉积及细胞内氧化应激水平，因此本研究进一步研究Ang(1-7)对FFA诱导的肝细胞损伤的影响，借此进一步完善RAS系统在肝脏脂质代谢的作用。本研究结果表明，游离脂肪酸作用于肝细胞可诱导L-02细胞脂质明显沉积，胞内氧化应激反应上调，ROS水平明显增强。Ang(1-7)可缓解FFA诱导的肝细胞脂质沉积，同时可降低细胞内ROS水平，减轻FFA导致的肝细胞功能失调。

细胞自噬(autophagy)是细胞内的一种自食(self-eating)现象，依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行吞噬、包被、融合的过程，以实现细胞稳态[14-15]，与多种疾病相关[16]。自噬可调节细胞内脂质水平[17]，缓解细胞脂质累积；细胞内自噬被激活以吞噬脂滴[18]，进而降低脂类对细胞所造成的损伤[19]；但过量脂质累积可抑制自噬。自噬也可调节细胞内氧化应激，降低ROS水平[20]。自噬在NAFLD疾病起调控作用[21]，而关于Ang(1-7)调节肝脏细胞内自噬水平以实现其对细胞功能调节的研究较少。本课题组前期实验表明AngⅡ可加强FFA所致肝细胞脂质沉积，而过量脂质沉积后肝细胞自噬下降。本研究结果证实Ang(1-7)可上调FFA诱导的脂质沉积的肝细胞内自噬水平，促进自噬调节脂质代谢，从而缓解细胞内脂质累积。脂质的累积可导致细胞内氧化应激水平上调，Ang(1-7)可通过促进自噬反馈降低细胞内氧化应激水平。

综上所述，Ang(1-7)可在细胞水平上调肝细胞内自噬水平，进而降低脂质累积及氧化应激水平，缓解FFA所致的肝细胞功能损伤及内环境稳态失调，可以保护肝细胞，由NAFLD状态逆转为基本正常状态，这可能为Ang(1-7)介导的肝细胞内自噬作为防治NAFLD进展提供新的防治思路及理论依据。