Th22/Th17细胞免疫平衡在乙肝相关性肝癌发生和发展中的作用

张海梅,郭虎林,申大年,刘琪,马苑宁

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)占肝癌的70%～90%，发病率高，死亡率高，是全球男性癌症死亡的第二大原因[1-2]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)长期感染是导致HCC产生、发展及治疗后复发的重要危险因素[3-4]。

Th17细胞亚群最早在自身免疫性疾病的动物实验模型中被发现，因其合成并分泌IL-17而被命名为“Th17细胞”[5]。IL-17可以有效介导炎症反应，导致组织器官自身免疫损害，在感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤的病理过程中发挥作用。

IL-22是新近发现的一类辅助型CD4+T 细胞，首先在胸腺淋巴瘤、T细胞和其他免疫细胞中由IL-9诱导产生[6]。在人类中，IL-22主要由Th1和Th22T细胞亚群产生，IL-22受体复合物由IL-22R/IL-10R2组成，其表达于各种器官的上皮细胞上[7]。主要分泌IL-22而不是IFN-γ/IL-17 13的辅助性T细胞的一个集合被命名为Th22细胞，在Th22细胞中起着重要的作用。众所周知，不同的T细胞亚群(Treg 12、Th17细胞)及其相关细胞因子在肝癌的发生发展中起着重要作用。

本研究中，我们收集乙肝相关性肝癌患者(观察组)30例及体检健康者(对照组)30例，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组血清IL-17、IL-22的含量，比较两组血清IL-17、IL-22的水平，并检测患者肝功能，分析IL-17、IL-22水平与肝功能血清生化指标的相关性。采用流式细胞术(flow cytometry，FC)检测两组外周血Th17和Th22细胞的外周频率，分析Th17、Th22细胞水平与肝功能血清生化指标的相关性，为该疾病的发病机制以及药物的靶向治疗提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

观察组患者均为我院2016年1月到2018年1月住院的乙肝相关性肝癌患者，诊断标准参见《CSCO肝癌诊疗指南》[8]。对照组均来自我院体检中心健康体检志愿者，既往均无肝病史，体检各项功能均正常。本项临床研究由青海省第五人民医院伦理委员会批准，所有受试者均了解试验项目并签署了知情同意书。观察组30例，男20例，女10例，平均年龄(50.76±6.50)岁；对照组30例，男25例，女5例，平均年龄(51.54±5.26)岁。两组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学差异(P>0.05，表1)，具有可比性。

1.2 样本采集

两组研究对象均于清晨采集空腹静脉血，离心后取上层血清，-20 ℃保存。

1.3 检测方法

1.3.1 ELISA 法

人IL-17和人IL-22酶联免疫检测试剂盒购买于南京建成公司。取血清按照试剂盒说明书进行操作，包括标准液配平、加样、洗涤、显色、终止，最后酶标仪分析软件测得OD值，得出标准曲线及样本浓度。

1.3.2 流式细胞术

eFluor-660联合人源抗IL-22购买于e生物科技公司，FITC联合IFN-γ和抗IL-17-PE购买于BD生物公司。按照说明书配置样本后，分别加入IL-17-PE和IL-22- PE，离心后加PBS上机，使用FlowJo software version 7.6.1进行分析。

1.4 统计处理

2 结果

2.1 两组外周血细胞频数的比较

采用流式细胞术检测乙肝相关性肝癌患者和健康志愿者外周血中Th-17和Th-22细胞频数，结果见图1。由图1a和图1b可知，观察组中外周血Th-17细胞频数高于对照组，图1c的统计结果显示差异有统计学意义(P<0.05)；同时，由图1d和图1e可知，观察组中外周血Th-22细胞频数高于对照组，图1f的统计结果显示差异有统计学意义(P<0.01)。

图a和b是乙肝相关性肝癌患者与健康人外周血Th-17细胞频数的流式细胞图，图d和e是Th-22细胞频数的流式细胞图；图c和f是Th-17、Th-22细胞频数的统计分析。观察组中外周血Th-17细胞频数高于对照组，t=2.561，P=0.013；同时，观察组中外周血Th-22细胞频数高于对照组t=4.089，P=0.000

图1两组外周血细胞频数的比较

2.2 两照组血清IL-17、IL-22含量的比较

采用酶联免疫吸附法检测乙肝相关性肝癌患者和志愿者外周血清中IL-17、IL-22浓度，结果见图2。由图2可知，乙肝相关性肝癌患者组血清中IL-17、IL-22的含量显著高于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图a显示观察组中血清IL-17水平高于对照组，t=2.486，P=0.016；图b显示观察组血清IL-22水平高于对照组，t=4.345，P=0.000图2 两组血清IL-17、IL-22含量的比较

2.3 对乙肝相关性肝癌患者血清IL-17、IL-22浓度与肝功能的相关性分析

对乙肝相关性肝癌患者血清IL-17和IL-22浓度与肝功能做相关性分析，结果见图3。由图3a和图3b可知，观察组血清中IL-17浓度与碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， AKP)、谷氨酰转移酶(gamma glutamyl transferase， GGT)水平呈正相关(P<0.05)；同时，由图3c和图3d可知，观察组血清中IL-22浓度与AKP、GGT水平呈正相关(P<0.05)。

图3 乙肝相关性肝癌患者血清IL-17、IL-22浓度与肝功能的相关性分析

2.5 乙肝相关性肝癌患者Th17与Th22细胞的外周频率与肝功能的相关性分析

对乙肝相关性肝癌患者外周血Th-17与Th-22细胞的频率与肝功能做相关性分析，结果见图4。由图4a和图4b可知，观察组血清中Th-17细胞百分率与AKP、GGT水平呈正相关(P<0.05)；同时，由图4c和图4d可知，观察组血清中Th-22细胞百分率与AKP、GGT水平呈正相关(P<0.05)。

3 讨论

乙型肝炎病毒(HBV)感染及其相关因素仍然是一个具有挑战性的全球公共卫生问题，大约有二十亿人被感染，全球HBV感染者780 000例感染每年死于肝硬化和肝癌。先前的研究已经证实了一些个体持续性HBV为无症状携带者，而其他人则为无症状携带者。在慢性期发展LC，最终发展成肝癌[9]。然而，HBV相关性肝癌的发病机制尚不完全清楚。随着全球范围内乙肝相关肝细胞癌的日益流行，确定可能导致这种疾病负担的潜在可变因素变得越来越重要。

系统性炎症反应综合征常见于肝癌患者，表明促炎细胞因子在肝癌的发生发展中起重要作用[10-11]。Thl7、Th22细胞的促炎症、促纤维化作用已经在各种肝病均得到证实[12-14]。Th17细胞的分化需要TGFβ1和IL-6的共同作用[15-16]。Th17细胞激活后能分泌产生IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22及肿瘤坏死因子等，并通过这些细胞因子促进其他炎症介质的释放。IL-17能够诱导肝细胞分泌急性期C反应蛋白，诱导Kupffer细胞、星状细胞等表达多种促炎因子和趋化因子[17]。

图4 乙肝相关性肝癌患者组Th17、Th22细胞的外周频率与肝功能的相关性分析

有研究表明，Th22细胞及其相关细胞因子参与乙型肝炎病毒的感染[18]，其分泌的IL-22通过与二聚体IL-22R、IL-22磷酸化激酶Jak1和Tyk2，然后激活转录因子STAT3，以及STAT5和STAT1[19]。IL-22-IL-22R通路参与炎症和损伤的不同组织反应[20]。不同的T细胞亚群(Treg 12、Th17细胞)及其相关细胞因子在肝癌的发生发展中起着重要作用。在对多种自身免疫性疾病包括银屑病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等研究中，均发现Th22细胞比例升高，并且与疾病的进展有关[21]。IL-22与许多感染性疾病及自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病的发病机制有一定的关联，IL-22通过JAK-STAT通路与许多肿瘤的发生发展密切相关，如结肠癌和肺癌等[22]。

在本研究中，我们收集观察组(即乙肝相关性肝癌患者组)及对照组(即健康人)的血清样本，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组血清IL-17、IL-22的含量，比较两组血清IL-17、IL-22的水平，并检测患者肝功能，分析IL-17、IL-22水平与肝功能血清生化指标的相关性。采用FC检测两组外周血Th17和Th22细胞的外周频率，分析Th17、Th22细胞水平与肝功能血清生化指标的相关性。

结果显示，观察组中血清IL-17、IL-22的含量以及Th17和Th22细胞的外周频率较对照组高(P<0.05)，表明乙肝相关性肝癌患者中Th17和Th22细胞表达异常，血清IL-17、IL-22的含量异常。观察组IL-17、IL-22与血清GGT、AKP水平呈正相关关系(P<0.05)，Th17、Th22细胞百分率与血清中GGT、AKP水平呈正相关关系(P<0.05)。AKP、GGT水平可反映肝脏的功能。表明Th17、Th22细胞百分率和IL-17、IL-22含量与肝脏的损伤程度成正相关，一定程度上反映肝脏的免疫炎症程度。

总之，乙肝相关性肝癌的发生与Th22、Th17细胞异常表达相关，可在一定程度上反映肝脏的免疫炎症程度。Th17/Th22细胞的过度表达是导致乙肝相关性肝癌自身免疫功能紊乱的重要原因，可成为治疗该疾病，恢复免疫功能的新靶点。