基于固态基底的SERS免疫检测新方法研究

贾小飞，荣振，何小羊，肖瑞，王升启

1.北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京100124；2.军事科学院 军事医学研究院辐射医学研究所，北京100850

免疫分析作为一种可靠、简单且便宜的方法，用于鉴定和定量复杂溶液样品中特定抗体或抗原的存在[1-2]。这种基于抗体与抗原特异性结合的检测方法已广泛应用于生化研究[3]、临床诊断[4]、环境监测[5]和食品安全检测[6]等领域。

表面增强拉曼散射（surface-enhanced Ra⁃man scattering，SERS）光谱具有光谱带窄、灵敏度高、多通道检测的优点，结合免疫检测技术，可以应用于蛋白质、病毒、细菌等的检测[7]。目前，基于SERS的免疫检测技术通常依赖于液态SERS免疫磁珠基底[8]、固态SERS免疫芯片基底[9]和SERS免疫层析基底[10]。在国内外的研究中，用于制备SERS免疫磁珠的磁性纳米颗粒包括银壳磁珠、金壳磁珠以及普通的羧基化磁珠，其中银壳磁珠和金壳磁珠具有SERS增强能力[11]。基于免疫磁珠的SERS免疫检测一般可实现单通道和双通道检测。而固态SERS免疫芯片基底由于具有预定义的多个孔阵列，可实现多通道检测[12]。固态SERS免疫芯片基底包括金膜基底、银膜基底、石英玻璃基底等，其中金膜基底/银膜基底可以与SERS检测探针[13]之间形成热点效应，达到高灵敏检测的目的；但是金膜基底/银膜基底制备复杂，价格昂贵[14]。石英玻璃是一种最简单的检测基底，但本身无SERS增强能力，只能依靠具有极强信号的SERS检测探针达到高灵敏检测的目的[14]。SERS-免疫层析检测技术是以条状纤维层析膜为固相基底，将SERS检测探针与免疫层析技术相结合的快速、高灵敏免疫分析方法，但也较难实现多通道和集成化检测[15-16]。

在本研究中，我们以醛基化单晶硅片作为SERS免疫检测基底，具有背景噪声低、性质均一和修饰方法简单等优点。在硅片基底上进行免疫检测人IgM，引入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体（羊抗人IgM-HRP），HRP催化5，5'-二巯基代双（2-硝基苯甲酸）-酪胺（DTNB-Tyr）标记的SERS检测探针（Au-DTNB-Tyr NPs）沉积，提供拉曼信号；利用金标银染技术，在金颗粒周围引入银颗粒，放大SERS信号，达到高灵敏检测的目的。且固态硅片基底具有高通量检测的潜力。此方法的建立可为多种相关疾病的集成化检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

氯金酸、硝酸银、柠檬酸钠（国药集团）；羊抗人IgM、人IgM、羊抗人IgM-HRP、5,5'-二巯基代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、酪胺（tyramine，Tyr）（Sigma公司）；DTNB-Tyr（本实验室合成）；银染试剂（本实验室配制，A液为硝酸银水溶液，B液为氢醌柠檬酸缓冲溶液）；单晶硅片（浙江立晶公司）；加热磁力搅拌器（北京世纪华科公司）；离心机（Eppendorf公司）；Milli-Q超纯水系统（Millipore获得）；Hitachi H-7650透射电镜（日立公司）；Shi⁃madzu 2600紫外分光光度计（岛津公司）；i-Ra⁃man Plus BWS465-785H拉曼光谱仪（B&W Tek公司）；ZEISS EVO LS10扫描电镜（蔡司公司）。

1.2 SERS检测探针（Au-DTNB-Tyr NPs）的制备

首先，利用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备Au纳米颗粒（Au NPs）。将100 mL 0.001 g/L的氯金酸溶液加热煮沸，搅拌，然后快速加入1.5 mL 0.1 g/L的柠檬酸钠溶液，继续加热20 min，制备出约31 nm的Au NPs溶液。

将2.5μL 10 mmol/L的DTNB-Tyr/乙醇溶液加入1 mL Au NPs溶液中，终浓度为25μmol/L，静置反应3 h，7000 r/min离心8 min，弃上清，用2 mmol/L硼酸钠缓冲液（BBS）洗涤1次，将SERS探针沉淀保存在2 mmol/L BBS溶液里备用。

1.3 基于硅片基底的SERS免疫检测人IgM

1.3.1 免疫芯片制备在醛基化硅片的各个孔阵列中央滴加1μL 1 mg/mL的捕获抗体（羊抗人IgM），孵育过夜；然后加入5μL 0.1 g/L的BSA溶液，37℃孵育2 h，以封闭未结合抗体的区域；用1×PBST洗涤，晾干，备用。

1.3.2 SERS免疫检测在免疫芯片的相应孔里加入5μL不同浓度的人IgM（1μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL），PBS作为空白对照，37℃反应30 min，1×PBST洗涤3次，晾干；在每个孔里加入5μL检测抗体（羊抗人IgM-HRP），37℃反应30 min，1×PBST洗涤3次，晾干；在每个孔里加入5μL SERS检测探针，37℃反应30 min，1×PBST洗涤2次，水洗1次，晾干；在每个孔里加入5μL银染试剂（A、B液等比例混合），避光反应2 min，水洗涤1次，晾干。

1.3.3 SERS信号采集使用便携式拉曼光谱仪，功率10 mW，采集时间5 s，任意选取反应区的5个点进行信号采集，在检测仪器上通过软件在1337 cm-1位移处读取峰值，在检测人IgM时，峰值越高表明IgM浓度越高。

2 结果

2.1 基于固态硅片基底的SERS免疫检测原理

基于醛基化硅片固态基底的SERS免疫检测原理见图1。在醛基化硅片的相应孔里包被捕获抗体，制备SERS免疫固态芯片，在反应孔里进行免疫检测人IgM，形成免疫复合物（抗人IgM-人IgM-抗人IgM-HRP），引入HRP，HRP催化酪胺偶联的SERS检测探针（Au-DTNB-Tyr NPs）沉积，利用金标银染技术，A液和B液在反应孔里发生还原反应，大量银离子被催化还原成银颗粒，起到放大SERS信号的作用，达到高灵敏和定量检测人IgM的目的。

2.2 SERS检测探针的表征

图2A的透射电镜图显示Au NPs大小均匀，分散性良好，适合制备SERS检测探针。图2B粒径分布图表明Au NPs的粒径大小约为31 nm，与预测大小相符。DTNB-Tyr通过金-巯键与Au NPs结合，制备Au-DTNB-Tyr NPs，图2C的紫外-可见吸收光谱结果表明，与Au NPs溶液相比，Au-DTNB-Tyr NPs溶液的吸收峰并未发生变化。图2D的拉曼光谱信号表明，Au-DTNB-Tyr NPs表现出DTNB的特征峰。以上结果均说明SERS检测探针Au-DTNB-Tyr NPs制备成功。

2.3 羊抗人IgM-HRP浓度的优化

按照1.3所述实验步骤检测一定浓度的人IgM（1μg/mL），选择不同稀释比例（1∶500～1∶5000）的羊抗人IgM-HRP进行实验，检测拉曼信号，获得拉曼光谱图（图3A），绘制不同浓度羊抗人IgM-HRP条件下的相对信号强度值（图3B）。结果表明，羊抗人IgM-HRP的用量决定了拉曼信号的强度，以DTNB位于1337 cm-1位移处的主峰用于比较SERS信号的强弱，其浓度在1∶500～1∶1000时拉曼信号强度较强，并且强度基本一致；当稀释至1∶1000以下时，拉曼信号强度急剧下降。所以，本研究选取羊抗人IgM-HRP的工作浓度为1∶1000。

2.4 基于固态硅片基底的SERS免疫检测定量分析人IgM

按照1.3所述实验步骤，检测不同浓度的人IgM。由图4A可见，当人IgM浓度降低时，免疫反应区域的SERS信号变弱，当人IgM浓度下降至10 pg/mL时，1337 cm-1位移处的主峰显著，空白对照几乎无信号。因此，基于硅片固态基底的SERS免疫检测人IgM的检测限是10 pg/mL。绘制以拉曼主峰1337 cm-1位移处的SERS信号强度和人IgM浓度（10 pg/mL～1μg/mL）对数之间的校正曲线如图4B，在人IgM浓度为10 pg/mL～1μg/mL时具有良好的线性关系（R2=0.993），误差线代表了5次独立测量值的标准差。

图1 基于硅片基底的SERS免疫检测原理示意图

图5是基于硅片固态基底的SERS免疫检测浓度为10 ng/mL和1μg/mL的人IgM的扫描电镜图，显示了银染前（图5A、C）和银染后（图5B、D）SERS检测探针和银颗粒的沉积情况，其沉积量与人IgM的浓度呈正相关。

3 讨论

在本研究中，我们建立了基于固态硅片基底的SERS免疫检测新技术，引入了新型SERS检测探针Au-DTNB-Tyr NPs，再结合金标银染技术，在SERS检测探针周围引入银颗粒，起到增强SERS信号的作用。通过上述SERS检测探针和金标银染技术的引入，可高灵敏定量检测人IgM，其检测限为10 pg/mL。

图2 SERS检测探针的表征

图3 不同羊抗人IgM-HRP稀释比例下的拉曼光谱（A）和在主峰1337 cm-1位移处的相对信号强度（B）

图4 基于固态硅片基底的SERS免疫检测定量分析人IgM

图5 基于固态硅片基底的SERS免疫检测浓度为10 ng/mL（A、B）和1μg/mL（C、D）人IgM的银染前（A、C）、后（B、D）扫描电镜图

应选取合适粒径大小的Au纳米颗粒制备SERS检测探针，若胶体金太小，SERS增强作用太弱，而太大的胶体金会有空间位阻，所以选取30 nm左右的Au NPs。合成的新型化合物DTNBTyr，既具有拉曼分子的特征，又具有HRP催化底物的性质；DTNB-Tyr修饰Au NPs制备的新型SERS检测探针，既可以提供拉曼信号，又可以被HRP催化发生沉积。

HRP可以催化底物酪胺发生沉积，但是在反应过程中不被消耗，所需量比较小。为了达到高灵敏和定量检测的目的，对免疫检测中所用的检测抗体（羊抗人IgM-HRP）的浓度进行了优化，其最佳工作浓度为1∶1000。

在银染前，SERS检测探针沉积在免疫反应区域，沉积的量与所检测人IgM的浓度有关，浓度越高（1μg/mL），沉积的量越多；浓度越低（10 ng/mL），沉积的量越少。在银染后，大量银颗粒被还原在SERS检测探针周围，银颗粒的沉积量与SERS检测探针的量也呈正相关。所以，此种SERS免疫检测方法可以达到定量和高灵敏检测人IgM的目的。此外，本研究中的SERS检测探针Au-DTNB-Tyr NPs可作为通用探针，结合固态基底的多通道特征，具有实现多种抗原或者病原体的集成化检测的潜力。