瑞戈非尼抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的研究

武瑾，赵鹏，姜棋予，马燕，张木子荷，王威，李树，郭妤姝

1.解放军总医院第六医学中心 药剂科，北京100048；2.内蒙古军区卫生防疫队，内蒙古 呼和浩特010051；3.解放军总医院第五医学中心 临床研究管理中心，北京100039；4.解放军总医院第一医学中心 消化内科，北京100039；5.解放军总医院第五医学中心 药学部，北京100039

乳腺癌是严重危害我国女性健康的恶性肿瘤，其患病率占所有恶性肿瘤的7%～10%[1]。根据雌激素受体（estrogen recptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）等的表达，乳腺癌可分为内分泌依赖型、HER2阳性型及三阴性乳腺癌[2]。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）约占所有乳腺癌类型的15%～20%，发病率较高，具有进展快、侵袭能力强、易发生局部复发和远处多发转移的特点，患者的生存期及预后较差[3-4]。近几年针对ER和HER2靶点的抗乳腺癌小分子药物和抗体相继投入临床使用，显示了一定的乳腺癌治疗效果，例如他莫昔芬、氟维司群、曲妥珠单抗等[4-5]。然而三阴性乳腺癌目前治疗策略选择较少，亟需能够治疗三阴性乳腺癌的药物和方法。瑞戈非尼（regorafenib）是拜耳公司研发的口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制血管生成、抑制肿瘤细胞增殖并调控肿瘤微环境，从而达到抑制肿瘤增殖与侵袭的目的[6]。目前美国食品药品管理局（FDA）已批准用于结直肠癌、胃肠道间质瘤及肝癌的治疗[7]。瑞戈非尼是否能够抑制三阴性乳腺癌目前尚无研究报道。本研究中，我们采用三阴性乳腺癌细胞的裸鼠皮下肿瘤模型和肝脏原位转移模型，探讨瑞戈非尼是否对三阴性乳腺癌具有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级免疫缺陷小鼠（BALB/c品系的胸腺缺失小鼠）购自北京市斯贝福生物科技有限公司；吸入麻醉剂异氟烷购自深圳沃瑞德公司；小动物实验相关手术器械为本实验室提供。实验动物饲养及动物手术于解放军总医院第五医学中心临床研究管理中心实验动物中心开展。饲养条件为温度22～23℃，环境湿度50%，自由进食和饮水，按3R原则给予人道关怀。

MDA-MB-231细胞系（高侵袭性三阴性乳腺癌细胞）[8]由解放军总医院第五医学中心冯帆博士惠赐，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养（均为Invitrogen公司产品）；分子实验RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；qPCR一步法扩增试剂盒购自KAPA公司；ABI 7500 Real-Time PCR仪为本实验室提供；肝脏肿瘤多发与弥散病灶照片的定量分析采用Image J软件（版本号1.51j8），由美国国立卫生研究院（NIH）发布。

1.2 免疫缺陷裸鼠皮下成瘤实验

在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养MDA-MB-231细胞，生长至80%密度时收集细胞并计数，用灭菌生理盐水重悬，备用。于5～6周龄BALB/c免疫缺陷小鼠双侧后肢内侧皮下注射上述MDA-MB-231细胞悬液，每个后肢注射细胞量为1×106，接种3 d后对小鼠进行灌胃给药，瑞戈非尼组给予2 mg/kg瑞戈非尼，对照组给予PBS溶剂对照，隔日固定时间给药。持续给药3周后处死动物，解剖小鼠下肢获得肿瘤组织，称重，测量肿瘤组织的长度与宽度，按照公式（肿瘤体积=肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2）估算肿瘤体积，并以肿瘤体积和肿瘤质量计算抑制率。

1.3 免疫缺陷裸鼠肝脏肿瘤多发与弥散病灶模型的建立[9]

在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养MDA-MB-231细胞，生长至80%密度时收集细胞并计数，用灭菌生理盐水重悬，控制细胞浓度为2.5×106/mL。用吸入麻醉剂异氟烷，麻醉机持续麻醉5～6周龄BALB/c免疫缺陷小鼠（首次麻醉浓度为3.5%，持续麻醉浓度为2.0%），并将小鼠固定。用灭菌手术器械沿腹部剑突下方按小鼠肝脏位置斜切1.5 cm开口，分离筋膜层，小心挤出肝右叶，暴露肝门静脉，用灭菌注射器向肝门静脉注射200μL上述MDA-MB-231细胞悬液，注入总细胞量为5×105。接种完毕，将肝脏轻柔推回腹腔内缝合，避免出血。按照1.2所述方法按瑞戈非尼组和对照组灌胃给药，3周后处死小鼠并对肝脏组织进行PET/CT检测。

1.4 小动物PET/CT检测

BALB/c免疫缺陷小鼠经尾静脉注射约200 μCi核素探针18F-FDG，30 min后收集动物血液标本，处死动物并解剖肝脏，立即对肝脏组织进行PET/CT检测，按照18F-FDG核素扫描模式，进行12 min扫描采像[10-11]。用盖革计数器测量肝脏和血液的核素强度，同时对肝脏组织进行拍照。

1.5 实时定量PCR（qPCR）实验

对1.2方法获得的皮下肿瘤研磨并提取总RNA，用一步法qPCR进行检测。设置三重复和阴性对照，分别检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白（vimentin）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、组织基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP-1）的基因表达情况，以GAP⁃DH为内参。qPCR实验使用的引物见表1。

1.6 统计学分析

结果以x±SD显示，统计学分析采用SPSS17.0软件，单因素方差分析比较x±SD方法计算P值，以P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 瑞戈非尼对MDA-MB-231皮下成瘤具有抑制作用

经过3周的隔日灌胃给药治疗，瑞戈非尼组小鼠皮下肿瘤明显小于对照组（图1A）。图1B为皮下肿瘤体积的定量结果，图1C为肿瘤称重结果，图1D为肿瘤体积和肿瘤质量的抑制率结果，瑞戈非尼对裸鼠皮下成瘤的肿瘤质量和肿瘤体积的抑制率约为63%。这表明，服用瑞戈非尼能够抑制三阴性乳腺癌细胞在裸鼠体内的生长。

2.2 瑞戈非尼对MDA-MB-231的裸鼠肝脏多发与弥散肿瘤病灶具有生长抑制作用

裸鼠经肝门静脉注射5×105三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231以模拟三阴性乳腺癌肝转移作用，接种细胞后即进行瑞戈非尼治疗，经过3周生长，瑞戈非尼持续给药能够显著抑制肝脏多发与弥散病灶的生长。对小鼠肝脏的PET/CT拍摄图片与定量结果显示（图2A、B），瑞戈非尼组动物肝脏相对于血液的核素信号明显低于溶剂对照组。经Image J软件对肝脏照片进行多发于弥散病灶面积定量（图C），瑞戈非尼组散发病灶面积显著低于对照组。这表明，瑞戈非尼对于三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231在裸鼠肝脏原位多发于弥散肿瘤模型中具有生长明确的抑制作用，其对乳腺癌肝转移等乳腺癌转移作用具有临床诊疗价值。

2.3 瑞戈非尼抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231增殖的分子机制

对瑞戈非尼组MDA-MB-231细胞在裸鼠皮下形成的肿瘤进行总RNA提取和qPCR实验，检测瑞戈非尼对MDA-MB-231细胞上皮-间质转化和转移、侵袭的影响。结果如图3A、B、C，瑞戈非尼能够升高MDA-MB-231上皮标志物E-钙黏蛋白表达，降低间质标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达，抑制MDA-MB-231的上皮-间质转化。图3D、E、F显示，瑞戈非尼能够降低MMP-3与MMP-9的表达，同时升高TIMP-1的表达，表明瑞戈非尼能够抑制MDAMB-231的转移和侵袭相关蛋白表达。

表1 qPCR实验引物

3 讨论

三阴性乳腺癌往往具有高侵袭性、易远处转移、化疗后易复发等特点，导致预后较差，越来越引起人们的重视。除此之外，对于化疗敏感的三阴性乳腺癌患者也仅有15%～20%，大部分患者没有有效的治疗药物[12]，因此研究三阴性乳腺癌新型有效的治疗方法显得尤为重要。目前研究[13]表明，三阴性乳腺癌缺乏特定的分子靶点，这增加了三阴性乳腺癌药物研发的难度。瑞戈非尼是一种多靶标蛋白激酶抑制剂，能够通过作用于肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成及肿瘤微环境相关靶点，发挥多重抗肿瘤作用。可抑制的靶点有VEG⁃FR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、TIE-2、BRAF、KIT、RET、PDGFR和FGFR，目前瑞戈非尼已获批用于治疗晚期结直肠癌、胃肠间质瘤和肝细胞癌。本研究结果揭示了瑞戈非尼对三阴性乳腺癌的体内生长与转移侵袭作用具有明确的抑制作用。

图1 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231裸鼠皮下成瘤

图2 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231在肝脏原位生长

图3 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231的上皮-间质转化和转移、侵袭

MDA-MB-231是高侵袭性的三阴性乳腺癌细胞系，也是目前相关研究最为公认和常用的模型。我们培养获得MDA-MB-231细胞建立裸鼠皮下肿瘤模型以及干门静脉注射建立裸鼠肝脏原位多发与弥散转移模型模拟三阴性乳腺癌在体内的增殖与肝脏转移，显示瑞戈非尼治疗对MDA-MB-231的体内生长与转移、侵袭作用具有明确的抑制作用。初步探讨了瑞戈非尼作用的分子机制。瑞戈非尼治疗能显著上调上皮标识物E-钙黏蛋白、下调间质标识物N-钙黏蛋白与波形蛋白的表达，表明瑞戈非能抑制MDA-MB-231的上皮-间质转化作用。同时，瑞戈非尼治疗还能下调MMP3与MMP9的表达，上调TIMP1的表达，表明瑞戈非尼能明确抑制MDAMB-231转移和侵袭相关蛋白表达以减缓细胞的转移与侵袭作用。上皮-间质转化是恶性肿瘤细胞恶变、转移/侵袭及抗肿瘤药物耐药的主要调节机制之一，而MMP能够直接降解与破坏细胞外基质与基底膜，最终加速恶性肿瘤细胞转移与侵袭作用。

综上所述，我们通过动物实验模型及机制实验，初步阐明了瑞戈非尼对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用，不仅拓展了对新型分子靶向药物瑞戈非尼的认识，也为三阴性乳腺癌治疗提供了更多可能选择。