侵染滇黄精的菜豆普通花叶病毒的检测与鉴定

陈泽历, 杨林毅, 陈 潞, 孙 雁, 魏朝霞, 李永忠, 赵明富*, 文国松*

1.云南农业大学农学与生物技术学院, 昆明 650201；2.云南农业大学, 农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室, 昆明 650201;3.云南农业大学烟草学院, 昆明 650201

滇黄精(Polygonatumkingianum)是百合科(Liliaceae)黄精属多年生草本药用植物，以根茎入药。《中国药典》规定滇黄精(Polygonatumkingianum)、黄精(Polygouatumsibiricum)、多花黄精(Polygouatumcyrtouema)为中药黄精的3种基源植物，俗称“大黄精”、“鸡头黄精”和“姜形黄精”，具有补益健脾、补气润肺、滋阴生津、补肾等功效[1]。野生滇黄精多生于林下、灌丛或阴湿草坡，有时生岩石上，主要分布于云南、四川、广西、贵州等省区。滇黄精中含有多种有效成分:滇黄精多糖(Polygonatumkingianumpolysaccharide，PKP)具有降血糖、降血脂、调节免疫等功效；总皂苷可改善学习记忆力、抗抑郁，也可调节血糖；黄酮类成分是黄精属植物的特征性成分，总黄酮具有抗氧化活性[2,3]。临床上常用滇黄精治疗脾气亏虚型血虚症、贫血症、高尿酸血症、痛风、顽固性咳嗽、小儿脾胃病以及男子不育症等[4,5]。近年来，随着对滇黄精研究的不断深入，其应用领域不断拓展，市场需求量也相应增加。野生滇黄精居群植株分布频度已接近稀少或枯竭[6]，因而人工种植产业得到发展，但大面积单一种植易使滇黄精发生较为严重的病害。目前已报道的滇黄精病害，如叶斑病、炭疽病、黑斑病等真菌性病害，严重影响着其药材产量和品质[7]，但滇黄精病毒病未见报道。

菜豆普通花叶病毒(Beancommonmosaicvirus，BCMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，最早是从被侵染的菜豆植株中分离获得的[8]，1934年Pierce[9]将其正式命名为BCMV。马铃薯Y病毒属成员的病毒粒子呈线状，大小为(680～900) nm×(11～13) nm[10]。BCMV基因组是1条全长约为9.6～10 kb的(+)ssRNA，结构特征与典型的Potyvirus成员相同，5′端具病毒基因组连接蛋白(virus genome linked protein，VPg)，3′端具有Poly(A)尾，在5′-UTR和3′-UTR之间含有1个开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码分子量约为350 kDa的具有蛋白酶活性的多聚蛋白，该多聚蛋白可被蛋白酶(P1、HC-Pro、NIa)切割产生10个成熟蛋白[11]。BCMV在全世界范围内均有分布，传播途径较多，主要经蚜虫非持久性传播，还可通过机械接种、种子和花粉传播。其寄主范围广泛，可侵染藜科、茄科、苋科、豆科、番杏科等9科44属的约100多种植物[12,13]，感病组织细胞质中可观测到圆柱状内含体在组织横切面呈风轮状结构[12]，而植物受侵染后通常表现为花叶、叶片皱缩或变窄、植株矮化，豆科植物出现豆荚斑驳或畸形，造成严重的经济损失[14,15]。

在本课题组前期调查滇黄精病害过程中，发现田间部分滇黄精表现出明显的花叶、叶片皱缩症状，与已报道的3种真菌性病害症状描述不同，而疑似病毒病，但此前未见BCMV侵染黄精属植物的报道。因此，为了鉴定引起该症状的病原，本研究结合电镜技术、血清学检测技术和RT-PCR技术对云南文山出现花叶、皱缩症状的滇黄精病样进行检测和鉴定，以期为后续滇黄精病毒病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

病样于2017年8月～9月采集自云南文山。在种植基地观察到侵染症状的滇黄精，拍照并收集疑似病毒侵染的植株，以其为样品进行病毒粒子提纯观察以及DAS-ELISA、RT-PCR检测。DAS-ELISA检测所用3份滇黄精病样编号为DHJ1、DHJ2、DHJ3。

BCMV的ELISA试剂盒购自美国Creative Diagnostics公司，pGEM-TeasyPCR产物克隆试剂盒购自美国Promega公司，植物总RNA提取试剂盒、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTPS、2×PowerTaqPCR Master Mix试剂盒等均购自北京百泰克生物技术有限公司，其他化学药品均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JEM-1200EXII透射电镜(日本电子株式会社)；CCD相机(美国GATAN公司)；ABI PRISMTM 377 DNA自动测序仪测定(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.3 BCMV病毒粒子电镜观察

取呈现花叶、皱缩症状明显的滇黄精病叶进行病毒粒子提纯，提纯参照Zhao等[16]的方法。提纯的病毒粒子用浸出法在电子显微镜下观察：用铺有Formver膜的电镜铜网沾取病毒粗提纯液，用吸水纸吸干，加1滴2%磷钨酸(pH 7.0)负染1 min，吸干，待干燥后用JEM-1200EXII透射电镜观察，并用GATAN CCD相机拍照。

1.4 血清学检测

取呈现花叶、皱缩症状明显的滇黄精病叶制样进行血清学测定。向样品中加入15倍体积的抽提缓冲液研磨，8 000 r/min离心5 min，取上清液作为待测样品。血清学测定采用DAS-ELISA，用抗BCMV的抗体，检测步骤按照BCMV ELISA Kit说明书进行。阳性对照来自于BCMV ELISA试剂盒，以健康滇黄精叶片为阴性对照，以缓冲液为空白对照。

1.5 病样总RNA抽提和PCR扩增

病样总RNA抽提采用离心柱型通用植物总RNA提取试剂盒，具体方法按说明书操作。PCR扩增引物为马铃薯Y病毒科特异性简并引物(Sprimer/M4T)[16]。

抽提所得总RNA用于合成cDNA第一链，合成所用引物为M4T，总体系20 μL：总RNA 5 μL，引物M4T 1 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，RNase Free ddH2O 7 μL，混匀后，于65℃温育5 min，置于冰上急冷，再加入5×first-strand Buffer 4 μL，200 U/μL M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL。逆转录反应程序为：30℃ 10 min，42℃ 60 min，95℃ 5 min，所得cDNA产物用于PCR扩增。随后采用2×PowerTaqPCR Master Mix试剂盒，反应体系参照说明书，反应体系(50 μL)：2×PowerTaqPCR Master Mix 25 μL，上游引物(Sprimer)5 μL，下游引物(M4T)5 μL，模板 2 μL，ddH2O 13 μL。反应程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30个循环；72℃ 10 min。最后利用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。

1.6 克隆和序列分析

将PCR产物直接克隆到载体pGEM-T Easy vector[16]。采用ABI PRISMTM 377 DNA自动测序仪测定，序列分析采用DNAMAN和MEGA 7.0。

2 结果与分析

2.1 发病概况及典型症状

为了明确引起滇黄精疑似病毒病症状的病原，本研究对云南文山种植基地的滇黄精进行病害调查，发现滇黄精病毒病大田发病率在9%～13%，正常植株叶片呈均匀的绿色、叶面平滑，植株健壮，而发病植株叶片呈花叶、皱缩症状，并且植株细弱(图1)。

2.2 电镜观察病毒粒子形态

将呈花叶、皱缩症状明显的滇黄精病叶提纯病毒粒子后，提纯的病毒粒子用浸出法在电子显微镜下观察，可观察到直线或弯曲线状病毒粒子，大小为(670～760) nm×(9～12) nm(图2)。而马铃薯Y病毒属成员的病毒粒子也为线状，由此推测滇黄精病样中可能含有该属病毒。

2.3 血清学检测

取侵染症状明显的滇黄精病叶，用抗BCMV的抗体进行DAS-ELISA检测，发现3份待测样品的OD405值分别为1.542、1.633、1.598，空白对照和阴性对照的OD405值分别为0.09和0.102，阳性对照OD405值为1.472(表1)，结果表明DHJ1、DHJ2和DHJ3与抗BCMV的抗体呈强阳性反应，可初步判定DHJ1、DHJ2和DHJ3可能含有BCMV。

图1 滇黄精正常植株与田间自然发病植株Fig.1 Normal plant and plant naturally infected with BCMV of Polygonatum kingianum.

图2 从滇黄精病样提取的线状病毒粒子Fig.2 Viral particles of BCMV purified from diseased leaves of Polygonatum kingianum.

2.4 PCR产物电泳检测及测序分析

为了进一步确定经ELISA检测的滇黄精是否的确存在BCMV，取ELISA检测呈阳性的病样DHJ1，进行RT-PCR验证。利用马铃薯Y病毒科属简并引物(Sprimer/M4T)进行扩增，结果扩增出大小约为1 700 bp的目的条带。对目的条带克隆并测序分析，结果表明，该PCR产物序列长为1 609 bp，包括部分NIb基因(588 bp)、CP基因(864 bp)和3′-UTR序列(157 bp)。在NIb蛋白的第30～32位存在保守基序GDD，推测NIb/CP裂解位点为VHLQ/SG(第193～198位)，CP氨基酸序列第208～210位存在与蚜传密切相关的保守基序DAG(图3)。滇黄精分离物，命名为BCMV-DHJ1，与已经报道的BCMV湖北大豆分离物(KJ807813)、山东花生分离物(Laixi isolate，KF439722)、山东花生分离物(TA11 isolate，HM776124)、浙江花生分离物(AJ889245)核苷酸序列同源性为91%～99%，相应区域NIb蛋白氨基酸序列同源性为99%～100%，CP氨基酸序列同源性为99%～100%(表2)。进一步分析菜豆普通花叶病毒滇黄精分离物BCMV-DHJ1与其他BCMV分离物的进化关系，利用MEGA 7.0软件构建该分离物和已报道的其他BCMV分离物CP氨基酸序列系统进化树(图4)，进行系统发育分析。结果显示BCMV-DHJ1与中国、美国、韩国、越南的分离物聚类为一簇，与花生(HM776124)和大豆(KJ807813)分离物亲缘关系最近，CP氨基酸序列同源性为99%～100%。

表1 DAS-ELISA检测结果Table 1 The detection results of DAS-ELISA.

表2 BCMV-DHJ1与其他BCMV分离物3′-端相应区域核苷酸序列和CP基因编码的蛋白氨基酸同源性比较Table 2 Comparisons of the 3′nucleotide sequences identity and animo acid sequences identity of CP among BCMV-DHJ1 and other BCMV isolates.

图3 BCMV-DHJ1分离物基因组3′-末端相应区域核苷酸及其编码的氨基酸序列Fig.3 The nucleotides and putative amino acids of the 3′-end in BCMV-DHJ1 genome.

3 讨论

根据不同Potyvirus属成员的CP氨基酸同源性应低于80%的分类标准，Potyvirus属成员外壳蛋白核心区域的同源性低于65%时病毒分离物属于不同种，同源性在72%～90%之间属于同一病毒的不同分离物[17,18]。结合电镜观察到的病毒粒子形态以及DAS-ELISA检测、病毒基因组3′-末端序列同源性分析和CP氨基酸序列系统发育分析的结果，表明引起滇黄精花叶、皱缩症状的病毒病原为BCMV。这是首次报道BCMV自然侵染滇黄精，因此将该病毒命名为菜豆普通花叶病毒滇黄精Ⅰ号分离物(BCMV-DHJ1)。该结果可为滇黄精病毒病害的生物防治及健康种苗繁育提供理论基础。

作为植物病毒检测的常用方法，PCR检测和ELISA检测2种方法各有所长，不可相互替代，为避免实验出现假阳性或者假阴性结果，2种方法要相互验证，直到取得一致结果。本研究对叶片呈现花叶、皱缩症状的滇黄精样品进行检测，利用2种方法均验证了BCMV的存在。

图4 基于已报道的BCMV外壳蛋白(CP)氨基酸序列构建的系统树Fig.4 Phylogenetic trees based on CP amino acid sequences of the previously reported BCMV isolates.

BCMV为马铃薯Y病毒属的重要成员，是豆科作物重要病毒之一，最早在美国报道[8]，在世界范围内都有分布[19]。BCMV除能侵染豆科外，还可侵染藜科、茄科和苋科等植物，给农业经济造成重大损失[13]。该病毒可经桃蚜、棉蚜以非持久性方式传毒，还可通过种子和花粉传播[12]。马铃薯Y病毒属Potyvirus多聚蛋白可被病毒基因组编码的3种蛋白酶(P1、HC-Pro、NIa)分解为10个较小的成熟蛋白，NIa-Pro蛋白酶负责切割多聚蛋白前体中-端的CI/6K2、NIa/NIb等多个酶切位点，裂解位点的识别模式均为V-X-X-Q(或E)-(A、S、G或V)，本研究中BCMV-DHJ1分离物氨基酸序列的NIb/CP裂解位点推测为VHLQ/SG，位于NIb蛋白第193～198位。Potyvirus成员的NIb蛋白从N端到C端含有GDD和GNNSGQPSTVVDNT等高度保守结构域。在这一区域，高度保守的GDD基序如果发生突变，突变为ADD后，依赖于RNA的RNA复制酶的酶活性降低，仅有野生型的7%。GDD保守区在结构上类似于ATP和GTP结合酶类的B保守区NTP结合位点，是所有动物、植物以及细菌、病毒依赖于RNA的RNA聚合酶的特征性保守序列[20]。CP蛋白与RNA包装、寄主范围及蚜传和症状诱导等功能有关，其N端的保守基序DAG与蚜传研究比较多，如果保守基序DAG发生突变，病毒的蚜传能力将受到影响，会部分或者全部丧失[21～25]。本研究中NIb蛋白的第30～32位存在保守基序GDD，CP蛋白第215～217位存在与蚜传密切相关的保守基序DAG。因此，蚜虫是否传播BCMV-DHJ1以及哪种蚜虫传播值得深入研究，另外BCMV在滇黄精上是否种传也有待研究。