三七近红外多指标快速质量评价

周雨枫， 董林毅， 杨哲萱， 张凤莲， 章顺楠， 周立红∗， 叶正良，3∗

（1.天津医科大学药学院，天津300070；2.天士力医药集团股份有限公司，中药先进制造技术国家地方联合工程实验室，天津300410；3.天士力控股集团有限公司，天津300410）

三七 Panax notoginseng（Burk.） F.H.Chen为五加科人参属植物的干燥根和根茎物［1］，属于珍贵的中药材。具有止血、活血化瘀、降血压、降血脂等多种作用。近年来，随着三七产业的不断发展，三七不同药用部位的开发研究越来越受到广泛关注。

三七按部位分类，分为主根、筋条 （侧根）、绒根 （须根）、剪口、花、叶6个部位，文献指出，三七不同部位内在成分含有量差异，可能影响临床用药的安全性与有效性［2］。数据显示，生产合格的三七粉，在投料时需考虑不同药用部位的质量特征［3］。但传统分析方法鉴别三七粉来源时，存在耗时长、前处理复杂等缺点，且对于不同部位的三七粉，单独采取传统某种分析方法，无法对各部位判别分析，需多种分析方法综合应用，且随着掺杂成分的不同，鉴别结果变数也大［4-5］。 《中国药典》规定三七饮片可以直接以粉入药，主要有效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和 Rb1。但没有规定三七粉的原料来源，药材经过粉碎后，失去了原来的形状特征［6］，容易掺伪。而且市售的三七主根粉容易掺杂其余部位，却仍以主根粉原价出售，并且难以通过感官辨别。

近年来，近红外光谱技术在中药行业得到大力推广，作为一种药材快检的高效分析方法而被广泛应用［3］，并应用于三七粉末的来源和真伪鉴别［7-9］，但目前尚未有报道利用近红外光谱技术对三七主根、筋条 （侧根）、绒根 （须根）、剪口、花、叶等所有部位的粉末进行判别分析。

本研究以三七的皂苷含有量为质控指标，利用NIRS结合PLS建立皂苷模型。同时结合主成分分析对三七不同部位分别进行定性鉴别，应用于三七主根粉的伪品分析，建立快速实用的多指标分析方法，为中药材的整体质量控制和评价提供参考［10］。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂 WATERS 269高效液相色谱仪 （美国 WATERS公司）；Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪马科技有限公司）；XS205电子分析天平 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；AntarisⅡ傅立叶变换近红外光谱仪 （美国Thermo Fisher Scientific公司）；DK-S14电热恒温水浴锅 （上海森信实验仪器有限公司）；MEMMERT UNE200干燥箱 （上海美墨尔特贸易有限公司）；高速中药粉碎机 （山东省青州市精诚医药装备制造有限公司）。乙腈 （批号 10900830728，色谱纯）、甲醇 （批号10901407732，色谱纯）（德国默克股份两合公司）；甲醇 （批号2017112032，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；三七皂苷R1（批号20130910，含有量92.78%）、人参皂苷Rg1（批号20130911，含有量94.63%）、人参皂苷Rb1（20131107，含有量95.87%）均由天士力医药股份有限公司提供；水为Milli-Q超纯水。

1.2 药材 三七主根53批，三七剪口、绒根、筋条、花、叶各5批，均由天士力医药集团股份有限公司提供，经浙江理工大学梁宗锁教授鉴定为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.） F.H.Chen的主根、筋条、绒根、剪口、花、叶。药材粉碎，过65目药典标准筛，分别混匀，装袋密封备用。

2 方法与结果

2.1 HPLC 参考药典方法［1］，测得主根皂苷含有量范围为5.85%～9.27%、筋条为5.69%～6.39%、剪口为10.12%～11.90%、绒根为4.48%～6.62%、花为2.51%～5.28%、叶为0.38%～0.69%，见表1。

表1 各样品中皂苷含有量测定结果Tab.1 Results of content determination of the saponins of various samples

2.2 光谱采集 采集方式为积分球固体采样。样品扫描次数64次，分辨率8.0 cm－1，每个样品采集2张光谱，计算平均光谱以建立模型。各部位三七主根的近红外原始光谱见图1。

图1 各样品不同部位近红外光谱图Fig.1 Near-infrared spectra of different parts of various samples

2.3 皂苷含有量模型

2.3.1 校正集和验证集 应用TQ Analyst 8.0软件，从53批样品中选择具有代表性的43批作为校正集，含有量范围分别为5.85%～9.27%，10批为验证集，含有量范围为6.09%～8.96%，验证集的含有量范围均在校正集之内，具有可验证性。

2.3.2 光谱预处理 近红外光谱中除了自身的光谱信息外，还容易受到仪器噪音以采集时固体粉末的颗粒大小和均一性的影响。在近红外定性模型中，常用的预处理方法有多元散射校正法（MSC）、 标准归一化法 （SNV）、 一阶导数法（FD） 等［11-12］。 以 内 部 交 叉 验 证 均 方 差（RMSECV）和R2作为评价指标，见表2，一阶导数得到的模型数据最好。

表2 不同预处理方法的影响Tab.2 Effects of different spectra preprocessing methods

2.3.3 选择建模波段 建模波段选择范围过窄，缺乏关键信息，范围过宽又会包含大量的噪音和多余信息，因此，选择最佳波段有利于提高模型的预测性和准确性［11］。由主根近红外谱图可知，7 500～12 000 cm－1吸收较少， 3 800～4 000 cm－1仪器噪音比较大，不适于建模。因此选择在 4 000～7 500 cm－1尝试建模，以 R2、RMSECV为评价指标，手动筛选后见表3。表明，4 100～7 250 cm－1为最佳建模波段。

表3 不同波长范围的影响Tab.3 Effects of different wavelength coverage

2.3.4 主成分数 主成分数量过多，模型太复杂，出现过拟合现象。数量太少，则提取的信息不全面，模型的预测性降低［11］。本实验以RMSECV为优化参数，RMSECV越小，模型的预测精度越高［13］，因此，确定最佳因子数为9。见图2。

图2 RMSECV随主因子数变化Fig.2 Changes of the RMSECV along with factors

2.3.5 建立定量模型 运用TQ Analyst 8.0软件，通过PLS法对三七主根的皂苷含有量建立定量模型。外部验证中实测值与参考值的相关图见图3。结果表明，RMSECV为0.278，R2为0.919 1，表明该模型的总体预测性高。

图3 实测值与参考值的相关性Fig.3 Correlation between measured values and reference values

2.3.6 模型的验证 根据2015版 《中国药典》HPLC法测定的皂苷含有量作为实测值，与近红外光谱建模后得到的预测值相比，见表4～5。表明，所建模型外部验证集的实测值与参考值最大绝对误差0.25，平均相对误差为1.52%，t检验P值为0.210＞0.05，表明验证集的预测值与参考值之间无显著性差异。结果表明，所建模型准确性高，预测性能好。

表4 模型验证结果Tab.4 Results of the modelling verification

表5 验证集参数比较Tab.5 Comparison of parameter of validation set

2.4 各部位判别分析定性模型

2.4.1 选择训练集与验证集 78批样品中随机选择5批主根，筋条、绒根、剪口、花、叶各1批作为验证集，其余作为训练集。训练集样本68批，验证集样本10批。

2.4.2 光谱预处理 应用TQ Analyst对样品建立NIR判别分析定性模型时，判别分析的错误类别越少，正确率越高。主分成因子分析区域贡献值越大表明信息越丰富，但超过95后表明光谱中噪声对样品自身信息干扰大，所以需要尽量控制低于95。并综合考虑各个类别的第1主成分和第2主成分的二维散点图中的区域分布是否明显来选择最佳的预处理方法。由表6～7得出，MSC＋一阶导数作为预处理方法正确率最高，分析区域贡献值最大。

表6 不同预处理方法的影响Tab.6 Effects of different preprocessing methods

表7 不同预处理方法的分析区域贡献值Tab.7 Contribution values of different preprocessing methods to the analysis area

2.4.3 建模波段 建模波段选择过宽，包含的冗余信息较多，使得模型的预测性降低；选择过窄，对应波段的信息不够丰富，没有代表性，判别分析正确率低。近红外定性分析时，波段靠近4 000 cm－1方向是合频区，越靠近往小的方向，峰的区分效果越好，重叠性越小，5 000 cm－1以上属于倍频区，越大峰形重叠越严重，而越靠近10 000 cm－1峰几乎都是重叠在一起。通过观察谱图差异主要在3 800～7 500 cm－1，经过不断手动优化尝试后，得到3 807.15～6 500.00 cm－1为最佳建模波段。见表8。

表8 不同波长范围的影响Tab.8 Effects of different wavelength coverage

2.4.4 主成分判别分析模型建立 经过上述分析，选择 MSC＋一阶导数作为光谱预处理方法，3 807.15～6 500.00 cm－1为最佳建模波段，建立近红外判别分析模型。见图4。

2.4.5 模型验证与评价 将选择的10批样品作为验证集来评价模型的预测准确性，结果发现10批验证集样品的类别鉴别正确率为100%。由此可得，模型的准确度高，预测性能好，可用于三七不同部位的定性鉴别。

图4 三七不同部位第1、第2主成分得分图Fig.4 Scores of the first and second principal components for different parts of Panax．notoginseng

2.5 三七粉伪品

2.5.1 三七伪品制备 三七花和三七叶的颜色相对主根而言比较深，颜色区分度比较明显，而筋条、绒根和剪口粉末颜色与主根接近，肉眼难以准确区分是否三七粉中掺有这些杂质，因此随机选择1批三七主根、筋条、绒根、剪口，将三者按不同比例进行混合，见表9，每份样品10 g，得到15种掺杂粉。

2.5.2 近红外光谱采集 分别将上述伪品粉末取约5 g置于旋转样品杯中，积分球固体采样，扫描次数64次，分辨率8.0 cm－1，每个样品采样2次取平均光谱以建立模型。

2.5.3 主成分判别分析 将15份伪品作为验证集，带入建立的近红外不同部位判别分析定性模型中，结果表明，该模型对三七粉中分别掺杂绒根10%、筋条45%、剪口60%及以上的伪品三七粉均可鉴别。见图5。

表9 不同比例主根与其他部位混合鉴别情况Tab.9 Mixed identification of different proportions of taproot and other parts

3 讨论

3.1 NIRS与HPLC对比 NIRS具有高效、无损、绿色、环保的优点，能实现在线分析和实时监测，并且没有复杂的前处理过程，能对三七各个部位通过模型进行鉴别。然而近红外光谱测定的是倍频及合频吸收，因此灵敏度较差，通常要求检测含有量大于1%；并且NIRS作为一种间接分析方法，需要大量的建模数据，基础数据的准确性，分析方法的精确性以及化学计量学选择的合理性等，都会影响最终的模型精度和预测性能［14］。而HPLC法可以定量测定物质含有量，数据精准，但前处理复杂繁琐、耗费时间长，且难以通过皂苷含有量来区分三七药材的不同部位。综合比较得出，近红外光谱技术在推广应用，需要有精确的一级数据和合理的化学计量学方法。

图5 掺杂三七粉的第一、第二主成分的得分图Fig.5 Scores of the first and second principal components of adulterated Panax．Notoginseng powders

3.1 定量研究 文献表明，三七不同部位总皂苷溶血性小，且三七主根总皂苷的免疫增强作用最好［15］。多糖组分在免疫调节方面活性显著，而三七不同部位中多糖含有量有明显差异，主根、筋条、毛根、花、茎叶和剪口中均含有多糖，其中主根含有量最高，茎叶含有量最低［16］。主根、筋条、剪口中的皂苷含有量和种类均不同，质量也有差异［17］。

本实验测得三七不同部位中，剪口皂苷含有量最高，其次主根，接着是筋条和绒根，二者含有量范围非常接近，而且与主根的含有量范围有重叠部位，接下来是花和叶，叶中皂苷含有量测定范围最低。在建立的皂苷含有量近红外模型中，实测值平行样品间最大偏差为1.91%，验证集样品的最大相对误差为3.42%，平均相对误差为1.52%，表明该模型准确性、预测性都较高。

3.2 NIR判别分析 目前企业生产时通常选择三七不同部位的原材料进行加工，市售合格三七粉通常是以三七主根作为原材料，三七的筋条和须根虽然都有一定的药用价值。但相对主根而言含有量较低，因此售价便宜，而剪口中皂苷含有量虽然比主根高，但不容易被人体直接吸收，通常用于企业制药。三七的筋条和绒根也有一定的药用价值，但有效成分相对较低，因此相对主根价格低廉。剪口主要成分含有量指标要远高于法定标准，但剪口和筋条的灰分指标有不符合标准的风险［3］。

本实验利用NIRS建立三七不同部位的主成分判别分析模型中，选择MSC和一阶导数作为预处理方法，3 807.15～6 500.00 cm－1为最佳建模波段，78批样品中1批分类错误，验证集分类正确率100%，总样品分类正确率为98.72%。

为了进一步验证模型的预测性能和提高模型的实用性，将三七掺杂粉作为验证集带入主成分判别分析模型中，在判别分析模型中，筋条、绒根和剪口含有量分别为10%、45%、60%及以上的三七掺杂粉均被鉴定出不是主根类别。经过主成分分析后，图5表明，随着三七粉伪品中筋条、绒根和剪口的比例不断增加，数据点不断从主根分布区域向这三个部位的分布区域移动，表9表明，三七伪品模型鉴别准确率高。

3.3 质量评价 本文采用近红外光谱法，对三七主根皂苷含有量建立了定量分析模型，对三七药材所有部位的鉴别建立了快速无损的定性分析方法。该模型经过验证，对三七主根粉伪品同样具有良好的鉴别能力，具有较强的实用性。结果表明，近红外光谱技术高效、便捷，可从定量和定性等多方面对三七药材进行整体质量评价，后期可通过不断增加样品量来提高各个模型的预测性和实用性。