大孔吸附树脂纯化紫菀总黄酮工艺

李园园， 李洪娟， 侯桂革， 赵 峰， 丛 蔚， 辛文妤， 郝聚伟， 王春华

（滨州医学院药学院，山东烟台264003）

紫菀是菊科紫菀属植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根和根茎，功效润肺下气、化痰止咳，临床上常用于治疗痰多咳喘、痰中带血、新久咳嗽等症状［1-4］。研究表明，紫菀中镇咳祛痰的药效物质包括紫菀酮、木栓醇等三萜皂苷类，以及槲皮素、木犀草素、橙皮苷、山柰酚、芹菜素等黄酮类［5-6］。

近年来，关于紫菀提取物药理活性的研究较多，但鲜有总黄酮纯化工艺的报道。大孔吸附树脂是一种高分子吸附材料，具有价廉、吸附性能好、能反复使用等优点，广泛应用于中药及复方中化学成分的分离与精制［7-13］。本实验探讨紫菀总黄酮的大孔吸附树脂纯化工艺，为该成分进一步应用提供依据。

1 材料

QYC-200恒温振荡器 （上海福玛实验设备有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 （巩义市予华仪器有限责任公司）；722N紫外-可见分光光度计 （上海仪电分析仪器有限公司）；KQ-400DB数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；EL204电子天平 ［梅特勒-托利多仪器 （上海）有限公司］。

紫菀提取物 （自制，总黄酮含有量2.62%）；芦丁对照品 （含有量大于98%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D101-I型大孔吸附树脂购于郑州勤实科技有限公司；HPD-300、HPD-450、HPD-600、HPD-826型大孔吸附树脂购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司；NKA-9型大孔吸附树脂购于天津南开和成科技有限公司，物理参数见表1。

表1 大孔吸附树脂物理参数Tab.1 Physical parameters for macroporous absorption resins

2 方法

2.1 总黄酮含有量测定 参照文献 ［14］方法并进行修正，以芦丁为对照品，紫外分光光度法测定总黄酮含有量。

2.1.1 线性关系考察 精密称取干燥后的芦丁对照品适量，60%甲醇溶解定容于25 mL量瓶中，精密吸取适量置于25 mL量瓶中，加入蒸馏水至6 mL，再加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，接着加入10%硝酸铝溶液 1 mL，充分摇匀后静置6 min，最后加入4%氢氧化钠溶液10 mL，定容，摇匀，静置15 min，于510 nm波长处测定吸光度。以对照品溶液质量浓度为横坐标 （X），吸光度为纵坐标 （A）进行回归，得方程为A＝0.012 7X－0.023 4 （R2＝0.999 6）， 在 12.61～75.65 μg／mL范围内线性关系良好。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取提取物5份，每份2.0 g，加入50 mL蒸馏水超声溶解，过滤，即得。

2.1.3 精密度试验 精密吸取供试品溶液1.0 mL，按 “2.1.1”项下方法测定吸光度5次，测得其RSD为1.17%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验 精密吸取供试品溶液1.0 mL，按 “2.1.1”项下方法测定吸光度，测得其RSD为0.87%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验 精密吸取供试品溶液1.0 mL，按 “2.1.1” 项下方法于0、15、30、45、60、90、120、180 min测定吸光度，测得其 RSD为1.44%，表明溶液在3 h内稳定性良好。

2.1.6 加样回收率试验 精密吸取含有量已知的供试品溶液6份，每份1.0 mL，精密加入芦丁对照品溶液0.5 mL，按 “2.1.1”项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，芦丁平均加样回收率为98.03%，RSD为1.33%。

2.2 静态吸附解吸实验 将预处理好的树脂滤干表面水分后称取2.0 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入提取物溶液，于恒温振荡器中连续振摇12 h（25℃、150 r／min），吸附完成后过滤，测定总黄酮质量浓度，按照公式计算树脂吸附量。吸附饱和后的树脂，先用蒸馏水100 mL洗除表面样品，再加入80%乙醇50 mL，恒温振荡器中振摇进行解吸，条件同上，解吸完成后过滤，测定解吸液中总黄酮质量浓度，按照公式计算树脂解吸量和解吸率。其中，Qe为树脂吸附量，C0、Ce分别为吸附前、后吸附液中总黄酮质量浓度，V0为吸附液体积，W为树脂质量，Qd为树脂解吸量，D为解吸率，Cd为解吸液中总黄酮质量浓度，Vd为解吸液体积。

2.3 吸附动力学实验 称取HPD-300树脂2.0 g，按 “2.2”项下方法吸附，在不同吸附时间取样，测定总黄酮质量浓度，计算吸附量，以吸附时间为横坐标，吸附量为纵坐标绘制吸附动力学曲线，用准一级、准二级动力学模型和颗粒内扩散模型对数据进行拟合，公式分别为 ln（Qe－Qt）＝lnQe－其中，Qt、Qe分别为在吸附时间t、平衡时总黄酮吸附量，K1、K2、Ki分别为准一级、准二级动力学模型和颗粒内扩散模型速率常数；C为颗粒内扩散模型常数。

2.4 吸附等温线实验 称取HPD-300树脂2.0 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入不同质量浓度提取物溶液50 mL，在25～45℃下于恒温振荡器中振摇吸附，吸附完成后测定总黄酮质量浓度，计算吸附量，绘制吸附等温线，通过Langmuir、Freundlich吸附等温模型进行拟合，公式分别为。其中， Q为树脂max最大量，KL为 Langmuir常数，KF为Freundlich常数，1／n为吸附指数。

2.5 动态吸附解吸实验 称取HPD-300树脂3份，每份15 g，湿法装入3根色谱柱中，取40、60、80 mg／mL提取物溶液，以2 BV／h体积流量上样，每1 BV收集1份流出液，测定总黄酮质量浓度，绘制泄漏曲线。然后，吸附饱和后的树脂柱，先用5 BV蒸馏水洗脱未吸附的样品及杂质，再依次用10%、50%、70%乙醇和纯乙醇各5 BV洗脱，每1 BV收集1份洗脱液，测定总黄酮质量浓度，绘制洗脱曲线。

3 结果

3.1 静态吸附解吸实验 图1显示，HPD-300、D101-I树脂为非极性树脂，HPD-600、NKA-9树脂为极性树脂，均对总黄酮具有较好的吸附效果，其中HPD-300树脂吸附能力最强，可能与它有较大的比表面积，能提供更多吸附位点有关，而且解吸能力也最强，故选择其用于分离。

图1 静态吸附解吸实验结果Fig.1 Results of static absorption／desorption tests

3.2 吸附动力学实验 图2A显示，随着吸附时间延长总黄酮吸附量不断增加，在0～120 min上升幅度较大，可能是由于开始时树脂表面活性吸附位点较多，吸附速率较快，之后逐渐减少，黄酮从树脂表面进入树脂内部孔径时受到一定阻力，吸附速率开始减慢，约在240 min左右达到平衡。图2B显示，颗粒内扩散呈现多线性阶段，而且拟合曲线没有通过原点，表明吸附速率是由液膜扩散和颗粒内扩散步骤共同控制。

图2 吸附动力学曲线 （A）和颗粒内扩散模型拟合曲线 （B）Fig.2 Kinetic curve for absorption （A） and fitting curve for intraparticle diffusion model（B）

然后，通过准一级、准二级动力学模型进行拟合，结果见表2。由表可知，总黄酮吸附更符合准二级动力学模型。

表2 总黄酮吸附动力学参数Tab.2 Absorption kinetics parameters for total flavonoids

3.3 吸附等温线实验 图3显示，吸附温度为25℃时总黄酮吸附量最高，45℃时最低，表明低温有利于吸附，即为放热过程；同一温度下随着质量浓度升高，总黄酮吸附量逐渐增加，说明样品质量浓度对树脂吸附能力也有较大影响。

图3 总黄酮吸附等温线Fig.3 Absorption isotherms for total flavonoids

然后，通过Langmuir、Freundlich吸附等温模型进行拟合，结果见表3。由表可知，总黄酮吸附同时符合2种模型，表明可能为单分子层吸附；在Freundlich模型中，n＞l时为优惠吸附，n＜l时为非优惠吸附，而本实验中所有n均＞l，表明该成分吸附为优惠吸附。

3.4 泄漏曲线 一般认为，当流出液中总黄酮浓度达到上样液中其浓度的1／10时，即达到泄漏点。图4显示，提取物质量浓度为40 mg／mL时，总黄酮在树脂上的泄漏点为11 BV；为60 mg／mL时，泄漏点为8 BV；为80 mg／mL时，泄漏点为3 BV，但此时总黄酮溶解性变差。为了节省上样时间，提高树脂利用率，并避免样品溶液浪费，选择60 mg／mL作为上样质量浓度，上样体积7 BV。

表3 总黄酮吸附等温参数Tab.3 Absorption isothermal parameters for total flavonoids

图4 总黄酮泄漏曲线Fig.4 Leakage curves for total flavonoids

3.5 洗脱曲线 吸附饱和后的HPD-300树脂，先用5 BV蒸馏水洗脱未吸附样品和部分水溶性杂质，再用不同体积分数乙醇洗脱，以洗脱液体积为横坐标，洗脱液中总黄酮质量浓度为纵坐标绘制洗脱曲线，见图5。由图可知，30%、70%乙醇及纯乙醇洗脱液中总黄酮质量浓度很低，无法破坏树脂和其之间的吸附作用力，该成分主要集中在50%乙醇洗脱液中，表明其洗脱能力较强。为了节省溶剂，提高总黄酮纯度，选择50%乙醇作为洗脱溶剂，上样体积5 BV。

图5 总黄酮洗脱曲线Fig.5 Elution curves for total flavonoids

3.6 验证试验 将7 BV提取物溶液 （60 mg／mL）上样到HPD-300树脂柱上吸附，吸附完成后先用5 BV蒸馏水洗脱杂质，再用5 BV50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏回收溶剂得纯化产物，测定总黄酮含有量。结果，该成分含有量由2.62%提高到40.01%，较纯化前提高了 15倍，收率为81.25%，表明HPD-300树脂纯化效果良好，可将其他非黄酮类杂质除去。

4 结论

本实验显示，HPD-300型大孔吸附树脂具有最大比表面积，表现出较好的吸附性能；紫菀总黄酮吸附过程符合准二级动力学方程，由液膜扩散和颗粒内扩散步骤共同控制；低温有利于吸附，为放热反应；吸附既符合Langmuir模型，又符合Freundlich模型，可能为单分子层吸附和优惠吸附；最佳条件为上样质量浓度60 mg／mL，上样体积7 BV，先用5 BV蒸馏水冲洗杂质，再用5 BV 50%乙醇洗脱，纯化后总黄酮纯度由2.62%提高到40.01%，收率为81.25%。

综上所述，该方法合理有效，在节省时间和溶剂的同时可获得高纯度紫菀总黄酮，适合该成分的规模化制备。