三叉苦质量标准的研究

甘杰华， 严 萍∗， 马 庆， 韩正洲， 詹若挺

（1.广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心，岭南中药资源教育部重点实验室，国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东广州510006；2.华润三九医药股份有限公司，广东深圳518002）

三叉苦 Melicope pteleifolia（Champion ex Bentham）T.G.Hartley为芸香科蜜茱萸属植物，又称三丫苦、三桠苦，始载于 《岭南采药录》，其性苦、寒，归心、肝经，有清热解毒、祛风除湿、消肿止痛等功效［1-2］，广泛分布于我国广东、广西、海南、福建、云南等地［3-5］，在1977年版 《中国药典》、《广东省中药材标准》 （第一册）、 《广西瑶族习用药材质量标准》（第一卷）等标准中均有收录［6-10］，其主要化学成分为生物碱、香豆素、挥发油、黄酮类等［10-15］。如今，三叉苦已广泛应用于三九胃泰、三九感冒灵等多种中成药中，但相关标准偏于简单 （仅有性状、显微和理化鉴别），故本实验对该药材进行质量评价，以完善其质量标准，具有较好的实际意义。

1 材料

1.1 仪器 KQ-700DE超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；XR205SM-DR电子天平 （瑞士Precisa公司）；Ultimate 3000高效液相色谱仪 （美国赛默飞世尔科技公司）；薄层成像系统 （瑞士Camag公司）；Milipore-Q超纯水系统 （美国Milipore公司）。

1.2 试药 10 cm×20 cm硅胶GF254预制薄层板（德国默克公司）。N-反式-对香豆酰酪胺 （批号wkq16031101，含有量 98%）、茵芋碱 （批号wkq16030105，含有量 98%）、白鲜碱 （批号wkq16020304，含有量98%）均购自四川省维克奇生物科技有限公司；吴茱萸春碱 （自制，含有量＞98%）。三叉苦对照药材 （批号 121682-201301）购自中国食品药品检定研究院；样品药材共20批（编号S1～S20，具体信息见表1），经广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心詹若挺研究员鉴定为芸香科蜜茱萸属植物三叉苦Melicope pteleifolia（Champion ex Bentham）T.G.Hartley的干燥茎。乙腈 （德国默克公司）、磷酸 （美国阿拉丁公司）为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 TLC定性鉴别

2.1.1 供试品溶液制备 取药材粉末5 g，加50 mL氯仿超声提取 （40 kHz、280 W） 30 min，放冷，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加5 mL甲醇溶解，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取吴茱萸春碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg该成分的溶液，即得。

2.1.3 鉴别方法 分别吸取供试品、对照品溶液6、4 μL，点于同一硅胶薄层板上，置于氨蒸气预饱和的展开缸内 （温度25℃，相对湿度60%），以石油醚 （60～90℃） -乙酸乙酯-乙醇 （6∶3.5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯 （254 nm）下检视，结果见图1～2。由图可知，供试品在对照品相应位置处显相同颜色斑点，分离度良好。

图1 三叉苦TLC色谱图 （Ⅰ）Fig.1 TLC chromatogram of M．pteleifolia（Ⅰ）

图2 三叉苦TLC色谱图 （Ⅱ）Fig.2 TLC chromatogram of M．pteleifolia（Ⅱ）

2.2 水分、浸出物、总灰分、酸不溶性灰分含有量测定 按照2015版 《中国药典》四部方法测定，结果见表2。

2.3 N-反式-对香豆酰酪胺、茵芋碱、白鲜碱、吴茱萸春碱含有量测定

2.3.1 色谱条件 Waters Xbridge HSS T3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脱 （0～15 min，25%乙腈；15～60 min， 25% ～40%乙腈）； 体积流量 1.0 mL／min；柱温25℃；检测波长240 nm；进样量10 μL。在上述色谱条件下，4种成分保留时间与对照品一致，分离度、拖尾因子符合要求，理论塔板数均达到5 000以上，色谱图见图3。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，加甲醇制成含N-反式-对香豆酰酪胺1.018 mg／mL、茵芋碱1.051 mg／mL、 白鲜碱1.012 mg／mL、 吴茱萸春碱1.036 mg／mL的溶液，精密量取适量置于25 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得 （含N-反式-对香豆酰酪胺0.025 45 mg／mL、 茵芋碱0.026 28 mg／mL、 白鲜碱 0.025 30 mg／mL、 吴茱萸春碱0.025 90 mg／mL）。

表2 水分、浸出物、灰分总灰分、酸不溶性灰分含有量测定结果Tab.2 Results of content determination of water， extract，total ash and acid-insoluble ash

图3 各成分HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.3 供试品溶液制备 精密称取药材粉末5.0 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入100 mL甲醇，密塞，超声提取30 min（40 kHz、280 W），放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，精密移取20 mL，水浴蒸干，甲醇溶于10 mL量瓶中并定容，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密量取 “2.3.2”项下对照品溶液，甲醇按一定比例进行稀释，在“2.3.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，得N-反式-对香豆酰酪胺、茵芋碱、白鲜碱、吴茱萸春碱回归方程分别为Y＝137.96X＋0.118 7（r＝0.999 7）、 Y＝1 081.5X＋0.950 3（r＝0.999 8）、Y＝1 775.1X－1.335 8 （r＝0.999 8）、 Y＝1 586.2X＋1.193 （r＝0.999 8）， 分别在 0.002 036～0.203 6、0.002 102～0.210 2、 0.002 024～0.202 4、0.002 072～0.207 2 mg／mL范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 取S10样品，按 “2.3.3”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得N-反式-对香豆酰酪胺、茵芋碱、白鲜碱、吴茱萸春碱峰面积RSD分别为1.71%、1.83%、1.81%、0.47%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取S10样品，按 “2.3.3”项下方法制备6份供试品溶液，在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定，测得N-反式-对香豆酰酪胺、茵芋碱、白鲜碱、吴茱萸春碱含有量RSD分别为1.91%%、1.60%、1.83%、0.68%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取 “2.3.6”下供试品溶液，在 “2.3.1” 项色谱条件下于 0、 2、 4、 8、 12、24 h进样测定，测得N-反式-对香豆酰酪胺、茵芋碱、白鲜碱、吴茱萸春碱峰面积 RSD分别为1.34%、1.26%、1.84%、0.49%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取含有量已知的S10样品，分别精密称取2.0、2.5、3.0 g，各3份，精密加入甲醇溶解的对照品溶液100 mL（按药材原有量的100%加入对照品），在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果 （n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.3.9 样品含有量测定 取S1～S20样品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，平行2份，在 “2.3.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表4。

3 讨论

3.1 TLC耐用性考察 本实验考察了TLC法在低温 （4℃）、常温 （25℃）、低湿 （32%）、高湿（88%），以及不同厂家薄层板条件下的耐用性。结果显示，该方法在不同温度、湿度条件下斑点清晰，分离度良好；在不同厂家薄层板上均有良好分离效果，以德国默克公司生产者最优。

表4 各成分含有量测定结果Tab.4 Results of content determination of various constituents

3.2 供试品提取方法和色谱条件考察 本实验考察了水、50%乙醇、乙醇、50%甲醇、甲醇，以及超声、回流提取15、30、45 min对三叉苦提取效果的影响，发现甲醇超声30 min时提取完全，而且操作简单。考察检测波长时，选择药材中含有量较高的生物碱作为对象，DAD检测器在200～400 nm波长范围内进行全波长扫描，发现各成分最大吸收波长分别为吴茱萸春碱244 nm、白鲜碱237 nm、茵芋碱 248 nm、N-反式-对香豆酰酪胺290 nm，综合考虑，选择240 nm作为检测波长。考察流动相时，选择甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸，以及0.05%、0.1%、0.2%磷酸、甲酸，发现以乙腈-0.1%磷酸为流动相时分离效果良好，干扰成分少。考察色谱柱适用性时，选择Ecoil HPLC C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）、 Waters Xselect HSS T3 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）、CAPCELL PAK MGII C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），发现以乙腈-0.1%磷酸为流动相时三者均可达到良好分离效果。

3.3 限量指标确定 本实验发现，20批三叉苦中N-反式-对香豆酰酪胺、茵芋碱、白鲜碱、吴茱萸春碱含有量差异较大，平均值分别为0.018 0%、0.010 1%、0.010 6%、0.020 8%，即以吴茱萸春碱含有量最高。为了便于控制药材质量，选择吴茱萸春碱作为限量指标，并建议其含有量不得低于0.015% （按干燥品计算）。

3.4 水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物限度确定 本实验发现，20批三叉苦中水分、总灰分、酸不溶性灰分平均含有量分别为5.84%、1.12%、0.06%，并建议三者分别不得超过8.0%、1.5%、0.1%。再考察水、稀乙醇、95%乙醇，以及冷浸法、热浸法对浸出物含有量的影响，发现稀乙醇提取效果最好，冷浸法、热浸法无明显差异，浸出物（冷浸法）平均含有量为5.05%，并建议其不得低于4.0%。