T淋巴细胞对高脂饮食引起的肠道炎症的影响①

余 璐 刘世博 董莉君 王 辉

(新乡医学院医学检验学院，新乡 453003)

肥胖是一种多因素的、在全球范围内流行的疾病，与多种慢性疾病相关[1，2]。肥胖及由它引起的各种代谢疾病，包括2型糖尿病、脑血管病(CVD)和癌症等，已成为21世纪威胁人类健康的重要因素，因此肥胖及相关的代谢综合征已成为当前研究的热点。

造成肥胖的因素很多，其中比较重要的便是饮食结构的改变，高脂饮食可诱导肥胖发生。而近年来的许多研究表明，高脂饮食可以改变人体肠道功能与菌群的群落结构，而肠道菌群可以影响人体脂代谢平衡，与肥胖的产生密切相关[3-6]。我们的研究提示高脂饮食会促进小鼠肠道菌群的变化、肠壁变薄以及通透性增加，比如淋巴细胞可能从肠道中漏出，然后通过微循环迁移至脂肪组织[7]。同时高脂饮食条件下，小鼠肠道内特别是中段小肠内发生一些与脂代谢、细胞周期及炎症免疫有关的分子改变，在尚未出现血清TNF-α升高的时候，肠道组织中特别是小肠组织中TNF-α已经出现升高，肠道炎症成为肥胖早期的信号。T细胞在免疫系统中处于核心地位，参与各种免疫应答，肥胖可以引起T淋巴细胞介导的各种免疫反应，那么T细胞对高脂饮食引起的肠道炎症过程中发挥什么样的作用呢？目前尚缺乏清晰答案。因此本研究通过使用T细胞缺失的小鼠模型，来探究T细胞对肥胖引起的肠道炎症的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 8周龄、质量约20 g的C57BL/6J小鼠购自北京维通利华公司；CD3ε基因敲除的小鼠由新乡医学院梁银明教授馈赠。两种小鼠各12只，均随机分成两组，每组6只，一组喂食正常饲料，一组喂食高脂饲料，实验重复3次。所有小鼠均饲养于SPF级别环境，8周大小开始高脂喂养小鼠，每7 d称量一次小鼠体重，监测生活状态。

1.1.2试剂 Trizol、逆转录试剂盒和SYBR green购自TaKaRa试剂公司。苏木素染色液、伊红染色液购于碧云天试剂公司。引物合成于华大基因公司。

1.2方法

1.2.1样本取材与处理 在实验后期，用苯巴比妥雾化吸入法麻醉小鼠，通过摘除眼球的方式取血，接着分离小鼠皮下脂肪、附睾脂肪、肠系膜脂肪以及肠道，分离出的皮下脂肪、附睾脂肪、肠系膜脂肪称量后，分别取3/5组织于新EP管中，标记清楚，立刻放于-80℃冰箱保存，各剩余2/5部分放于包埋框中，置于4%多聚甲醛中，浸泡48 h后，放于脱水机中进行脱水。从胃以下取下整个肠道组织后，用灭菌过的PBS进行冲洗，分出十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠部分，冲洗干净后分别取3/5组织于新EP管中，标记清楚，立刻放于-80℃冰箱保存，各剩余2/5部分放于包埋框中，置于4%多聚甲醛中，浸泡24 h后放于脱水机中，脱水后的组织取出后石蜡包埋。

1.2.2组织学分析和免疫组化 脂肪及肠道组织用4%多聚甲醛固定，脱水浸蜡后进行石蜡包埋、切片、摊片、烤片，然后分别进行苏木精-伊红染色(H&E)以及进行免疫组织化学(IHC)观察。

1.2.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 各种组织的总RNA的抽提使用TaKaRa试剂公司的Trizol试剂及逆转录试剂盒，并严格按照配套说明书进行操作。基因的转录本使用Applied Biosystems公司的7500 Fast real-time PCR system进行扩增，基因相对表达量采用2-ΔΔCt。所用引物序列如表1所示。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in real-time PCR

2.1高脂饮食诱导肥胖模型产生 我们将小鼠分成4组后，分别对野生型小鼠的一组和CD3ε基因敲除小鼠的一组进行高脂饮食喂养，构建肥胖模型。本实验体重数据是由每周测一次体重得到，取第2、4、6、8、10、12、14、16周的数据，绘制小鼠体重变化曲线，进行统计学分析。各组小鼠的体重第4周时开始出现明显的变化，到高脂喂养16周结束后，高脂饮食后的野生型小鼠质量显著高于正常饮食的野生型小鼠[(40±2.02)g vs (30±2.00)g]，高脂饮食后的CD3ε基因敲除小鼠质量也高于正常饮食的CD3ε基因敲除小鼠[(33±0.50)g vs (29±1.10)g]，肥胖组小鼠体重增长速率明显高于对照组，存在显著性差异(图1B)。接着我们处死小鼠，解剖取出白色脂肪，分别称量了4组小鼠的皮下脂肪(SAT)、附睾脂肪(EAT)、肠系膜脂肪(MAT)以及肾周脂肪(PAT)的重量，高脂饮食组明显高于正常饮食组小鼠(图1C)，且在整个体重的占比中，高脂饮食组也是明显高于正常饮食组小鼠(图1D)。这些证据表明，肥胖模型建立成功。

2.2高脂饮食导致野生型小鼠肠道组织发生炎症 有文献报道肥胖时，脂肪组织中出现炎症，同时也会影响其他组织及器官[8]，同时我们之前做过研究，高脂饮食后肠道中会出现炎症[7]，于是我们对各组小鼠肠道组织的相关炎性因子及肠道形态进行了检测。我们采用qRT-PCR方法测定结肠组织炎症因子mRNA的表达水平，在高脂饮食的野生组小鼠IL-1β、IL-5、IFN-γ、TNF-α基因的mRNA表达水平相比对照组均被显著上调(P<0.05)，同时IL-6的表达水平也出现上调现象(P<0.05)(图2A)，说明高脂饮食能够引发结肠炎症。同时通过对结肠组织的病理学切片H&E染色可以看到高脂饮食组肠黏膜发生炎性改变(图2B)，同时高脂饮食组结肠组织肌层厚度明显变薄(图2C)，说明了高脂饮食可以诱发结肠组织炎症，与之前的报道结果一致。

2.3T细胞缺失对高脂饮食导致的结肠组织炎症的作用 为了证实T细胞在高脂饮食导致的肠道炎症中起作用，我们采用了T细胞缺失的小鼠模型。T细胞根据其表达受体(TCR)类型的不同分为αβT(CD4+或CD8+SP) 细胞和γδT(CD4-CD8-DN)细胞[9，10]，众所周知，CD3是T细胞的表面标志性分子，不论是αβT细胞，还是γδT细胞，都表达ε，因此将CD3ε基因敲除后，T细胞是不存在的。于是分别取野生型与CD3ε基因敲除组小鼠的脾脏和血液进行流式检测，基因敲除组小鼠脾脏和血液中不含T细胞，说明敲除成功(图1A)。通过qRT-PCR检测相关炎性因子，高脂饮食的基因敲除组小鼠的促炎因子IL-1β、TNF-α(P<0.01)、IL-5、IFN-γ(P<0.05)、 IL-6的mRNA表达与高脂饮食的野生型组相比显著降低(图3A)，说明T细胞缺失时对高脂饮食引起的炎症反应有一定抑制作用，同时HE染色图可以更加直观地观察到肠道的变化(图3B)，可以看到当基因敲除组的小鼠高脂饮食后，与野生型小鼠高脂饮食后的结肠HE图对比肠壁厚度增加(图3C)，因此当T细胞缺失时，由高脂饮食导致的肠道炎症逐渐恢复，T细胞缺失对高脂饮食导致的肠道炎症有抑制的作用。

图1 高脂饮食诱导肥胖发生Fig.1 High fat diet induced obesity

2.4T细胞在高脂饮食导致的肠道炎症过程中对免疫细胞有影响进而影响炎症 为了探究T细胞在高脂饮食导致的肠道炎症中如何发挥影响，对免疫细胞有什么影响，我们取小鼠结肠部分进行免疫组化实验，

图2 高脂饮食导致野生型小鼠肠道组织发生炎症Fig.2 High fat diet causes inflammation in intestinal tissue of wild type mice

图3 T细胞缺失对高脂饮食导致的结肠组织炎症有作用Fig.3 Absence of T cells has an effect on colonic tissue inflammation induced by high-fat diet

图4 T细胞在高脂饮食导致的肠道炎症过程中对免疫细胞有影响进而影响炎症Fig.4 T cells affect immune cells in process of intestinal inflammation caused by high-fat diet and then affect inflammation

通过对巨噬细胞F4/80的染色，也可以看到，当野生型小鼠高脂饮食后，巨噬细胞浸润明显增多(图4)，而T细胞缺失的小鼠高脂饮食后，巨噬细胞反而减少(图4),说明T细胞的缺失影响了肠道中巨噬细胞的浸润，进而也对高脂饮食导致的肠道炎症有影响。

3 讨论

肥胖是由不同炎症因子诱导产生的一种全身性的慢性低度炎症状态[11]。在肥胖个体的脂肪或血清中，能够观察到高水平的炎症因子如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等。同时已有一些证据提示，肥胖会导致机体其他器官发生炎症[12，13]。而长期的高脂饮食会导致肠道中出现炎症性细胞因子水平的增高，特别是肠道组织中IL-6、TNF-α出现升高，因此肠道炎症成为肥胖早期的信号，最终导致代谢炎症的发生[14，15]。

本研究使用T淋巴细胞缺失的小鼠进行实验，通过对CD3ε基因敲除小鼠和野生型小鼠高脂饮食后发现，高脂饮食使野生型小鼠相关炎性因子，如IL-1β、IL-5、TNF-α、IL-6、IFN-γ表达上调，当T淋巴细胞缺失后(CD3ε基因敲除)，高脂饮食组基因敲除小鼠相关炎性因子，相比野生型小鼠明显下调。有文献报道IFN-γ、TNF-α、IL-6等细胞因子在炎性反应时会明显升高[16，17]，我们的发现与之前的报道结果一致，说明肥胖引起了肠道炎症的发生。同时，我们发现高脂饮食后野生型小鼠肠黏膜炎性发生改变，免疫组化结果提示结肠组织巨噬细胞增多，符合肠道炎症改变，与炎性因子的表达也是一致的。当T淋巴细胞缺失后，小鼠结肠组织肠壁变厚，免疫组化结果显示结肠组织中巨噬细胞浸润减少，当T淋巴细胞缺失后，小鼠结肠组织肠壁变厚，免疫组化结果显示结肠组织中巨噬细胞浸润减少，可能是由于T淋巴细胞的缺乏，导致T淋巴细胞分泌的促炎因子减少，从而使肠道炎症减弱。说明T淋巴细胞在肥胖导致的炎症发生中起到了重要作用。

众多临床研究证实肥胖会导致机体发生炎症，而通过免疫细胞来探究肠道炎症与肥胖之间关系的报道仍旧很少，而我们的研究从免疫细胞的角度探究了免疫细胞与肥胖导致的炎症的关系。总的来说，我们的研究通过采用了全身缺失T淋巴细胞的小鼠模型，揭示了T淋巴细胞对高脂饮食引起的肠道炎症有减缓的作用，并初步探究T淋巴细胞可以通过改变巨噬细胞的数量发挥功能。然而，在高脂饮食诱导肠道炎症发生的过程中，T淋巴细胞究竟是如何招募或活化免疫细胞来发挥作用的？而高脂饮食后形成肥胖以及高脂饮食过程中发生肠道炎症这两个过程，是肠道炎症发生进而产生肥胖，还是肥胖诱导了肠道炎症的发生，机制仍旧是未知的，这些问题都需要我们进一步研究。