BK通道抑制剂对人脐带华通胶来源的间充质干细胞的增殖、凋亡及细胞因子的影响

宋阿会 佟琰 刘英莉

间充质干细胞（MSC）是一类具有多向分化和自我更新能力的细胞，大量研究证明了间充质干细胞在各种疾病治疗中的作用，尤其是可以通过自分泌和旁分泌等作用参与免疫疾病的调控[1-2]。MSCs能够通过分泌细胞因子（如TGF-β、PGE2等）抑制T细胞增殖，促进Th1细胞向Th2细胞转化，影响B细胞成熟和抗体产生等，参与机体的固有免疫和适应性免疫，也能够促使髓样细胞分化，从而发挥抗炎和免疫负调控的作用[3]。最近研究表明，人脐带华通胶来源的间充质干细胞 （Human umbilical cord Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells，WJMSC）与BMSC具有类似的形态和细胞表型[4]，但WJ-MSC表达的HLA-ABC分子较少，免疫原性更低，且来源于丢弃的脐带，不受伦理限制，更有希望应用于各种疾病的治疗[5]。

大电导钙依赖性钾（BK通道）分布于神经元、各脉管系统、肾小球、肾小管等细胞膜上[6-8]，参与血压调控，神经递质释放，维持钾离子平衡等生理活动[9]。BK通道是由α亚基单独或联合不同类型的β亚基组成的G蛋白偶联的跨膜蛋白，包含感应膜电位的电压敏感性跨膜域（Voltage sensing domain，VSD），结合钙离子的胞质内域（Cytosolic domain），以及负责钾离子内流的门孔通道功能域（Pore gate domain，PGD）[8]。研究发现，BK通道也参与各种炎症的调节作用，如哮喘疾病中BK通道激活剂能够减轻气道反应[10]；同样，BK同道还参与IL-1b诱导的单核细胞和内皮细胞的黏附[11]，有望成为炎症治疗的靶点。此外，有研究已经在BMSC上发现了BK通道的表达和活性，且发现BK通道活性能够影响BMSC的增殖和分化能力[12]。但是，目前尚无研究证实BK通道活性对WJ-MSC的细胞活性和凋亡的影响，以及是否影响WJ-MSC分泌细胞因子。本研究尝试探索BK通道抑制剂预处理WJ-MSC后对其细胞活性和凋亡的影响，并通过检测预处理后其炎症因子（IL6，IL10）的表达，探究BK通道抑制剂是否影响WJMSC的旁分泌作用，明确BK通道抑制剂对WJMSC的免疫特性的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和耗材

αMEM培养基（Hyclone，美国），胎牛血清（Bioind，以色列），青霉素和链霉素（Gibco，美国），0.25%胰蛋白酶（Gibco，美国），CCK－8检测试剂盒（Rainbio，上海睿安生物科技有限公司），Annexin-V-FITC/PI试剂盒（BD，美国），Elisa检测试剂盒（Bioligand，美国），PBS溶液（Hyclone，美国），Hanks溶液（Gibco，美国），Paxilline（Alomone，美国），电转液、电泳液（生工生物工程有限公司，中国），BKα抗体（Alomone，美国），GAPDH抗体（Proteintech，美国），RIPA（碧云天，中国），蛋白磷酸酶抑制剂混合物（索莱宝，中国）。

超净工作台、细胞培养箱（Thermo，美国）；多功能酶标仪（BioTek，美国），流式细胞分析仪（Beckman，美国），电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；超敏化学发光成像系统（GE公司，美国）。

1.2 细胞培养和预处理

1.2.1 原代细胞的分离培养

经孕产妇知情同意，取其剖宫产分娩时舍弃的新鲜脐带组织（标本来源于上海市第一妇婴保健院），装入事先预冷的含有1%青霉素和链霉素的PBS溶液中。将脐带组织以PBS洗涤数次，去除血液后移至Hank's溶液中，去除两条脐静脉和一条脐动脉，剥离外皮，暴露中间的胶冻样的华通胶，剪成小段。将剪成段的华通胶移入空培养皿中，晾干，将其剪至1 mm3大小，用勺子将其铺至T75培养瓶底部，反转培养瓶，在组织块对侧加入10 mL含有10%胎牛血清和1%双抗的αMEM培养基，于37℃培养箱中过夜。8～16 h后，将培养瓶反转使培养基漫过组织块，继续培养约2周。至组织块周围有细胞爬出时，去除组织块，用0.25%胰蛋白酶消化约30～60 sec，中止消化后1 000 r/min离心5 min，重悬后接种至新培养皿中，每3天换一次液。取第3～7代细胞用于后续实验。

1.2.2 WJ-MSC预处理

取第3～7代WJ-MSC细胞，以106个/孔接种至6孔板，待其生长至80%融合时加入不同浓度的Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）孵育24 h，取上清或细胞用于后续检测。

1.3 Western－b lot检测BK通道的表达

取第3～7代WJ-MSC细胞，以106个/孔接种至6孔板，待其生长至80%融合时去除上清，加入RIPA和蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物配置的裂解液，裂解细胞，用BCA法定量各组蛋白浓度后，加入适量5×loading buffer，100℃煮10 min。配置8%的SDSPAGE胶，将3个不同来源的脐带华通胶间充质干细胞所提取的蛋白样品在上样前100℃煮5 min，以80 V恒压电泳至染料达胶底部，220 mA恒流转膜2 h，膜在5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，加入一抗，4℃过夜孵育8～16 h，TBST洗3次，二抗室温孵育1 h，TBST洗3次后显色。Image J软件分析灰度值。

1.4 琼脂糖凝胶电泳检测编码BK通道的KCNMA1基因表达

采用TRIzol法提取第3～7代细胞总RNA，利用Prime Script RT Master Mix （Takara036A）将RNA逆转录为cDNA，采用PCR法扩增KCNMA1基因，所得产物在1.5%的琼脂糖胶中进行电泳。KCNMA1基因正向引物序列为：5’-GGCAGCAGTCTTAGAATGAGTAG-3’；反向引物序列为：5’-AAAGCCCACCACATGCGTT-3’。

1.5 CCK－8法检测细胞活性

细胞预处理后，各孔加入10μL CCK－8，37℃孵育4 h后，用微孔酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度值。

1.6 Annexin-V-FITC/PI检测细胞凋亡

细胞预处理后，用0.25%胰蛋白酶消化各孔细胞，取一组空白组作为空白对照，其余各孔细胞消化后1 000 r/min离心5 min，弃上清，用100μL Annexin Buffer重悬后加入4μL AnnexinV，避光孵育10 min，加入4μL PI后立即上机检测。

1.7 Elisa法检测细胞因子

取细胞预处理后的上清，按照Elisa试剂盒步骤依次检测各组IL6、IL10浓度。

1.8 数据处理及统计学分析

所有实验均用GraphPad软件统计分析3次独立实验结果，计算各组间均值和标准差，多组间差异比较用ANOVA one-way检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代WJ-MSC上BK通道的表达

光镜观察发现，原代WJ-MSC为梭状，似成纤维细胞，与间充质干细胞描述一致（图1）。Westernb lot检测显示，3个不同来源脐带组织的原代WJMSC提取的蛋白质，均可检测到BK通道抗体表达（图2）。同时，以琼脂糖凝胶电泳在这3个不同标本来源的间充质干细胞上鉴定到了编码BK通道的KCNMA1基因的表达（图3），即不同来源的脐带华通胶分离的间充质干细胞均有BK通道的表达。

图1 光镜下原代WJ-MSC形态Fig 1 The morphology of primary WJ-MSC cells under optical microscope

图2 不同标本来源WJ-MSC中BK通道的表达Fig.2 The protein expression of BK channel in different WJ-MSC was detected

图3 不同标本来源WJ-MSC中编码BK通道的KCNMA1Fig.3 The gene KCNMA1 encoding BK channel in WJ-MSC

2.2 不同浓度Paxilline对WJ-MSC活性的影响

不同浓度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）处理WJ-MSC 24 h后，用CCK-8试剂盒检测各组在450 nm处的吸光度值。结果显示，低浓度的BK通道抑制剂Paxilline对细胞活性没有明显影响，而高浓度Paxilline（1μM、10μM）可显著降低细胞活性（P<0.01）（图4）。

图4 CCK-8法检测不同浓度BK通道抑制剂对WJ-MSC活性的影响Fig.4 The cell viability of WJ-MSC was detected by CCK－8 after treated with different

2.3 不同浓度Paxilline对WJ-MSC凋亡的影响

不同浓度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）处理WJ-MSC 24 h后，收集细胞上清及细胞，通过Annexin-V-FITC/PI试剂盒检测细胞凋亡情况。结果显示，高浓度Paxilline（10μM）可明显增加Annexin-V单阳细胞的比例，促进WJ-MSC细胞的凋亡（P<0.01），而低浓度Paxilline对WJ-MSC细胞的凋亡无明显影响（图5）。

图5 流式细胞分析仪检测不同浓度BK通道抑制剂处理WJ-MSC后凋亡细胞比例Fig.5 The cell apoptosis ratio of WJ-MSC was detected by flow cytometry after treated with different concentration of BK channel inhibitors

2.4 不同浓度Paxilline对WJ-MSC分泌IL6、IL10的影响

不同浓度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）处理WJ-MSC 24 h后，用Elisa检测试剂盒检测各组上清中IL6和IL10的浓度。结果显示，各浓度Paxilline均能够促进WJ-MSC分泌IL6（P<0.01），但并不增加IL10的分泌（图6）。

图6 Elisa法检测不同浓度BK通道抑制剂对WJ-MSC分泌的IL6和IL10的表达Fig.6 The expression of IL6 and IL10 secreted by WJMSC was detected by Elisa after treated with different concentration of BK channel inhibitors

3 讨论

大量的研究均肯定了间充质干细胞在各种疾病中存在的治疗作用，亦可通过分泌细胞因子、生长因子、胞外囊泡等发挥抗炎、免疫调控等作用[2，13－14]。由于表面分子表达的差异，不同来源的间充质干细胞具备的免疫特性有所差异[15]。其中，WJ-MSC来源更原始，免疫原性更低。同时，研究还发现，通过一些干预方法预处理间充质干细胞能够改变其免疫调节能力[16]，如使用低浓度LPS预处理MSC后，能够增强MSC对高浓度LPS介导的凋亡的耐受作用[17]。本研究利用组织贴壁法成功从人脐带组织中分离培养出WJ-MSC，利用Western－b lot检测了WJ-MSC上BK通道的表达，与BMSC研究结果一致，BK通道也存在于WJ-MSC上[12]。Paxilline可选择性抑制BK通道，在不同浓度（0μM、0.1μM、1μM、10μM）预处理下，高浓度Paxilline能够抑制WJ-MSC的细胞活性，促进其凋亡。表明抑制BK通道活性能够降低WJ-MSC的细胞活性，促进其凋亡。

研究表明，BK通道参与各种炎症过程的调节，如BK通道抑制剂能够减少LPS刺激下巨噬细胞分泌的炎症因子（TNFα），能够减轻胰腺炎小鼠模型中巨噬细胞炎症反应等，但目前尚无研究探究BK通道抑制剂对WJ-MSC分泌的炎症因子的影响。细胞因子IL6可由多种类型细胞分泌产生[18]，发挥不同的效应：①可诱导肝脏细胞合成急性时相蛋白（如C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A）等，启动急性炎症反应[19]；②作用于骨髓，可促进血小板释放[20]；③与TGF-β共同促进CD4+的T细胞向Th17细胞分化，上调Th17/Treg细胞的比例，促进自身免疫性疾病以及慢性炎症的发展[21]。细胞因子IL10则主要由受刺激的髓样细胞和淋巴细胞产生[22]，能够抑制促炎因子的分泌，增强B淋巴细胞分化及抗体的产生[23]。这两种细胞因子的平衡有助于调节多种疾病的炎症反应过程[18]。本研究发现，抑制BK通道后可明显增加WJ-MSC分泌IL6的水平，但不影响其IL10的分泌。表明BK通道的活性能够影响WJ-MSC细胞因子的分泌，进而影响其在免疫反应中发挥调节作用。

本研究存在一定的局限性。首先，还需通过细胞电生理实验，以进一步验证WJ-MSC上BK通道的活性；其次，针对BK通道的抑制只使用了抑制剂，或可利用shRNA敲减WJ-MSC上的BK通道后进行验证，同时由于一直没有探索出原代干细胞的过表达质粒构建条件，尚缺乏过表达BK通道以进一步检验上述结论。此外，虽然BK通道抑制剂能够促进WJ-MSC分泌的IL6水平，但抑制BK通道后对WJ-MSC的免疫负调控作用的影响尚需进一步研究明确。