车前子的利尿作用研究及发现

吴秋焱,马瀚林，张震宇，毕经会，冯婉滢，李 懿，吴文惠，战 旗

(山东中医药大学,山东 济南 250355)

车前子来源于车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressssa Willd.的干燥成熟种子， 性甘、寒， 归肝、肾、肺、小肠经， 具有清热利尿通淋、渗湿止泻、明目、祛痰的功效， 临床上多用于热淋涩痛、水肿胀满、暑湿泄泻、目赤肿痛和痰热咳嗽[1]。现代研究表明，车前子的化学成分为环烯醚萜类、生物碱类、黄酮类、多糖类、苯乙醇苷类、三萜类以及甾醇类等化合物，其中环烯醚萜类和黄酮类为其主要化学成分[2-3]。药理作用方面，具有镇咳平喘祛痰、抗炎、抗氧化、利尿、降血糖、降压、调血脂、调节免疫以及缓泻作用[2-4]。本实验采用大鼠水负荷模型，收集6h内的尿液，测定尿液中总盐重量、血尿素氮浓度和碳酸酐酶水平，研究车前子不同炮制规格的利尿作用，为临床应用提供有效依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HH-2型数显恒温水浴锅(江苏东鹏仪器制造有限公司)；LP 202J型电子天平(常熟市梦兰百灵天平仪器有限公司)；303-O型台式培养箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)；GFL-230型恒温干燥箱(天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司)；SHZ-DⅢ型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；XD-52A型旋转蒸发器(上海贤德实验仪器有限公司)；Epoch酶标仪(美国Bio Tek公司)。

1.2 药物与试药

车前子(济南市三源药业，批号：171201)，经山东中医药大学生药系主任李峰教授鉴定为车前科植物平车前Plantago depressssa Willd.的种子；氢氯噻嗪片(常州制药厂，批号：18020611)；大鼠尿素氮(BUN)ELISA试剂盒(中国酶免公司，批号：MM-20555R1)；大鼠碳酸酐酶(CA)ELISA试剂盒(中国酶免公司，批号：MM-0489R1)；水为纯化水。

1.3 实验动物

SD大鼠，雄性，体质量(270±10)g(济南朋悦实验动物繁育有限公司)，合格证号：SCXK(鲁)20140007。

2 实验方法

2.1 车前子不同规格炮制品的制备

参照《中国药典》[1]2015年版一部中车前子的炮制方法，以生车前子为原料，分别得到生车前子、清炒车前子和盐炙车前子。

2.2 给药液的制备

称取生车前子500g，80%乙醇浸泡12h，4倍量80%乙醇回流提取3次，每次2h，过滤,回收溶剂至干。提取物用0.9%NaCl溶液混悬,分别制成含药量1.6，0.4，0.1g·mL-1的给药溶液。清炒与盐炙车前子给药液的制备方法同生车前子。阳性对照药氢氯噻嗪用0.9%NaCl溶液配成0.4mg·mL-1的给药溶液。

2.3 动物筛选

采用Aston法，将实验鼠预先禁食(不禁水)18 h ,灌胃去离子水2.5 mL·100g-1,收集2 h 尿量,选择2 h 出入量比值>40%的鼠继续进行以下实验[5]。

2.4 动物分组

取上述筛选合格的大鼠55只，随机分为11组，每组5只，分别为:空白对照组(给药生理盐水)，阳性对照组(给药0.4mg·mL-1的氢氯噻嗪)，生车前子醇提物高剂量组(以下简称SCG组，含药量1.6g·mL-1)、中剂量组(以下简称SCZ组，含药量0.4g·mL-1)、低剂量组(以下简称SCD组，含药量0.1g·mL-1)；清炒车前子醇提物高剂量组(以下简称CCG组，含药量1.6g·mL-1)、中剂量组(以下简称CCZ组，含药量0.4g·mL-1)、低剂量组(以下简称CCD组，含药量0.1g·mL-1)；盐炙车前子醇提物高剂量组(以下简称YCG组，含药量1.6g·mL-1)、中剂量组(以下简称YCZ组,含药量0.4g·mL-1)、低剂量组(以下简称YCD组，含药量0.1g·mL-1)。

将大鼠置于标准鼠笼适应2天，代谢笼中适应3天，实验前禁食(不禁水)18h，以减少粪便的干扰。每组大鼠按25mL·kg-1体质量，用生理盐水灌胃，造成水钠潴留状态。30min后，实验开始，轻压动物下腹,排尽余尿。各实验组给予含受试药物的0.9%氯化钠溶液25mL·kg-1，空白组给予同体积的生理盐水。收集大鼠2,4,6h的尿液。连续给药6天。第6天给药1h后处死大鼠，取血约2mL,立即放入低温离心机中,1000r·min-1离心5min,得到血清。将血清至于-20℃冰箱冷冻保存。

2.5 尿液中总盐的测定

将收集的尿液立即用称量至恒重的滤纸吸尽，105℃烘干3h，冷至室温后称定重量。

2.6 血尿素氮浓度测定

第6天给药1h后处死大鼠，取血约2mL,立即放入低温离心机中,1000r·min-1离心5min,得到血清。然后按大鼠尿素氮(BUN)试剂盒说明书操作。(如果不是立即实验，得到血清后要将血清至于-20℃冰箱冷冻保存)。

2.7 碳酸酐酶水平测定

操作同血尿素氮浓度测定，血清恢复原状后按大鼠碳酸酐酶(CA)试剂盒说明书操作。

2.8 统计分析

3 实验结果

3.1 不同规格的车前子醇提物对大鼠尿液中总盐的影响

由表1可知，与空白对照组相比，2h内阳性对照组、YCZ组有明显的利尿作用(P<0.05)，SCZ组、SCG组、CCD组、YCG组利尿作用尤其显著(P<0.01);2～4h，YCD组利尿作用明显(P<0.05)，CCD组利尿作用尤其显著(P<0.01);4～6h各组车前子均无利尿作用。该结果表明在4小时以内车前子具有利尿作用。利尿作用强弱：盐炙>清炒>生品。

表1 不同规格的车前子醇提物尿液中总盐重量( ±s,n=5) g

表1 不同规格的车前子醇提物尿液中总盐重量( ±s,n=5) g

组别2h2～4h4～6h空白对照组0.108±0.002970.110±0.001900.176±0.00053阳性对照组0.228±0.00497∗0.094±0.004430.184±0.00068SCD组0.135±0.002290.058±0.001370.150±0.00110SCZ组0.260±0.00055∗∗0.100±0.002150.142±0.00117SCG组0.236±0.01118∗∗0.145±0.004300.160±0.00127CCD组0.256±0.00033∗∗0.218±0.00087∗∗0.140±0.00385CCZ组0.168±0.000870.076±0.0014130.204±0.00423CCG组0.175±0.009430.120±0.003870.213±0.00036YCD组0.150±0.00570.047±0.00173∗0.157±0.00463YCZ组0.214±0.00028∗0.104±0.002280.188±0.00137YCG组0.330±0.00025∗∗0.196±0.009080.176±0.00053

注：与空白对照组相比，*P<0.05,**P<0.01。

3.2 不同规格的车前子醇提物对大鼠血尿素氮浓度的影响

由表2可看出,各组 尿素氮浓度：SCZ组>YCZ组>SCD组>空白对照组>阳性对照组>YCG组>CCD组>YCD组>CCG组>CCZ组>SCG组。与空白对照组相比，SCG组尿素氮浓度有明显差异(P<0.05)，其他组无明显差异，该结果说明高剂量生车前子醇提物(1.6g·mL-1)对大鼠肾小球过滤功能有影响[6]。

3.3 不同规格车前子对大鼠碳酸酐酶水平的影响

由表3可知，各组碳酸酐酶浓度：SCZ组>SCG组>CCD组>YCZ组>YCG组>SCD组>CCZ组>空白对照组>CCG组>阳性对照组>YCD组。与空白对照组相比，YCD组碳酸酐水平有显著差异(P<0.05)，其他组无明显影响。

表3 各组大鼠碳酸酐酶浓度

表3(续)

3.4 实验发现

实验过程中SCG组、CCG组、YCG组均出现不同程度的腹泻，其中YCG组腹泻最严重。SCG组给药第4天开始腹泻，CCG组、YCG组给药第一天即出现腹泻。

4 讨论

本实验通过比较不同组别大鼠尿中总盐重量，发现三种炮制规格的车前子醇提物在0～4h内均有明显的利尿作用，与颜升[7]等人的实验结果相似。利尿作用强弱为：盐炙车前子>清炒车前子>生车前子。其中，盐炙车前子醇提物中，高剂量组利尿作用最明显；清炒车前子醇提物中，低剂量组利尿作用最明显；生车前子醇提物中，中剂量组利尿作用最明显。这可能与车前子炮制后化学成分发生了质和量的变化[8]有关。本实验尿素氮浓度测定结果显示，高剂量生车前子醇提物对血尿素氮浓度影响显著，表明其对肾小球的过滤有影响。本实验碳酸酐酶浓度测定结果显示，低剂量盐炙车前子醇提物组碳酸酐酶浓度有显著降低，表明低剂量盐炙车前子能抑制碳酸酐酶[6]。

此外，实验中还发现三种炮制规格的车前子醇提物高剂量组都出现不同程度的腹泻。与张丹[9]等的实验结果不同。经比较，张丹等的提取方法为醇水双提法，给药浓度为1.0g·mL-1,与本实验的提取方法和给药浓度不同，固化学成分的含量会有差别，从而得到不同的实验结果。查阅文献发现，车前子的致泻成分为车前子多糖[10-11]，由此可得，本实验中各高剂量组大鼠出现的腹泻是由提取物中多糖成分含量较高引起。

综上所述，本实验对不同炮制规格、不同浓度的车前子的利尿作用研究，证实盐炙车前子的利尿作用最强，且高浓度的不同炮制规格车前子都有致泻作用；车前子利尿作用的有效浓度范围和致泻的最低浓度尚不明确，有待进一步研究。