ANIT诱导的亚急性肝内胆汁淤积大鼠肠道菌群结构的变化

姚嘉明 陈芝芸 陈曦 刘彬彬 叶蔚 张洁

作者单位：310007 杭州市中医院（姚嘉明 刘彬彬 叶蔚 张洁）

310006 浙江省中医院（陈芝芸）

641000 四川省内江市第一人民医院（陈曦）

肝内胆汁淤积是一种临床常见病，指因各种原因导致胆汁的形成、分泌和（或）排泄出现异常，出现肝内胆汁酸和其他有毒化合物积累引起肝损伤的病理状态。该病发生原因复杂，常见病因主要有病毒、细菌、寄生虫、药物和/或毒物、自身免疫、雌激素、酒精、全胃肠外营养、肿瘤和遗传代谢等。胆汁淤积与肠道微生态破坏可互为因果，探索肝内胆汁淤积发病时肠道菌群的变化对该病的防治具有重要意义。作者自2015年1月至2018年9月使用ANIT间歇性多次给药成功建立了亚急性肝内胆汁淤积大鼠模型，并取新鲜粪便进行16s rRNA高通量测序观察其肠道菌群结构变化情况，旨在为该病的肠道微生态动物实验研究提供必要的实验数据及理论依据。

1 材料及方法

1.1 实验动物 SD大鼠16只，雄性，清洁级，体重190～210g，由上海市西普-必凯实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（沪）2013-0016。

1.2 主要试剂 异硫氰酸萘酯（ANIT）由上海百灵威化学技术有限公司提供。

1.3 分组及处理 16只SD大鼠随机分成正常组和模型组，每组各8只。模型组于实验第1天灌服1.6%浓度的异硫氰酸萘酯（麻油配制）80mg/kg，1次/周，连续4次，末次灌胃后48h处理大鼠；正常组以等容量的麻油灌胃代替；所有大鼠予以标准大鼠饲料喂养，自由饮水。各大鼠于处理前16h禁食不禁水，空腹麻醉下取血，分离血清待用；于大鼠腹部去毛局部消毒，剖腹无菌取回盲部新鲜肠内容物放入灭菌EP 管，液氮冻存后送检进行16s rDNA测序分析。

1.4 检测方法 采用全自动生化仪检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）水平。采用磁珠法提取大鼠肠内容物DNA，16s rRNA基因测序方法进行肠道菌群检测，由杭州谷禾信息技术公司采用Illumina MiSeq测序仪完成，平均每个样本的clean reads≥10万条，使用高可变区的PCR扩增产物建库，用QIIME软件进行菌群丰度、多样性及组成等分析。

1.5 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 19.0软件包。计量资料符合或近似符合正态分布数据，以（±s）表示，采用独立样本t检验进行两组间比较；不符合正态分布数据采用中位数和四分位数间距表示，采用Mann-Whitney U检验进行两组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 亚急性肝内胆汁淤积大鼠血清肝功能水平的变化 见表1。

注：与正常组比较，*P＜0.01

2.2 亚急性肝内胆汁淤积大鼠粪便16s rRNA高通量测序分析 （1）测序概况：总共测得了704424个样本序列，其中578567个序列获得了OTUs（operational taxonomic units）注释。分析结果显示，模型组测得的样本序列数目、OTU数目、注释上OTU的序列数目较正常组均明显减少（见表2，P＜0.01），提示模型组大鼠肠道菌群丰度较正常组降低。（2）各组样本Alpha多样性分析：Alpha 多样性反映的是单个样本内部的物种多样性，包括ACE指数、chaol指数、coverage、shannon 指数和Simpson 指数等。本研究对各组样本的alpha多样性进行计算，并绘制出相应Shannon-Winner曲线。①各组菌群丰度评估：通过ACE指数和Chao1指数评估两组样本的菌群丰度。结果显示，ANIT灌胃后大鼠肠道菌群丰度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。②各组菌群多样性分析：通过shannon指数和Simpson指数评估各组样品菌群多样性。结果显示，两组大鼠肠道菌群多样性未见显著性差异（P＞0.05）。见表3。③样品文库覆盖率评估：为衡量样本取样深度，进行Coverage指数和Shannon-Winner曲线分析。各组样本Coverage 指数均趋近于96 %（见表2），提示测序深度已经基本能够覆盖该微生物群落中绝大多数细菌。各样本的Shannon-Winner曲线趋于平坦，表明测序已趋于饱和，测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息，适合下一步的数据分析和研究。（3）各组大鼠肠道菌群门水平丰度分析：模型组大鼠粪便样品中OTU总数较正常组明显减少（见表4，P＜0.01），两组样本优势菌门包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门。正常组覆盖19个菌门，以拟杆菌门（Bacteroidetes）占比最高，其次分别为厚壁菌门（Firmicutes）及变形菌门（Proteobacteria），分别占51%、40%、6%，模型组覆盖17个菌门，拟杆菌门（Bacteroidetes）比例较正常组有升高趋势，其余两门比例较正常组下降，但两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 5。

表2 样本测序概况（±s）

表2 样本测序概况（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01

分组 n SampleSize OTUsNumber OTUsSeq Coverage模型组 8 37308.63±9185.27* 2342.75±334.76*29821.38±8445.769* 0.95±0.01正常组 8 50744.38±5743.58 3141.75±307.81 42499.50±5427.72 0.96±0.01

表3 各组样本Alpha多样性分析（中位数及四分位数间距）

表4 各组大鼠粪便各水平OTU数量（±s）

表4 各组大鼠粪便各水平OTU数量（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.01

分组 n 门 纲 科模型组 8 1792.88±243.32* 1792.88±243.32* 1581.88±222.29*正常组 8 2366.38±218.60 2366.38±218.60 2079.88±197.90

表5 各组大鼠粪便中菌群门水平相对丰度变化［%，（±s）］

表5 各组大鼠粪便中菌群门水平相对丰度变化［%，（±s）］

菌门 正常组 模型组Bacteroidetes 51.24±15.24 58.29±9.59 Firmicutes 40.53±12.43 36.11±8.86 Proteobacteria 6.71±3.66 4.42±1.25

2.3 各组大鼠肠道菌群纲水平丰度分析 正常组测得36个菌纲，模型组测得30个菌纲。两组大鼠粪便样品中纲水平占比居前10位分别为拟杆菌纲（Bacteroidia）、 梭 状 芽 胞 杆 菌 纲（Clostridia）、δ-变 形 菌 纲（Deltaproteobacteria）、γ-变 形 菌纲（Gammaproteobacteria）、 芽 孢 杆 菌 纲（Bacilli）、β-变 形 菌 纲（Betaproteobacteria）、ε-变 形 菌纲（Epsilonproteobacteria）、4C0d-2、 产 芽 胞 菌 纲（Erysipelotrichi）、Coriobacteriia。见表 6。

表6 各组大鼠粪便中菌群纲水平相对丰度变化［%，（x±s）］

2.4 各组大鼠肠道菌群科水平丰度分析 正常组测得72个菌科，模型组测得70个菌科。各组大鼠粪便样品中科水平占比居前12位分别为普雷沃菌科（Prevotellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、S24-7、Paraprevotellaceae、 毛 螺 菌 科（Lachnospiraceae）、韦荣氏球菌科（Veillonellaceae）、脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、 拟 杆 菌 科（Bacteroidaceae）、肠 杆 菌 科（Enterobacteriaceae）、 紫 单 胞 菌 科（Porphyromonadaceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、螺杆菌科（Helicobacteraceae）。见表7。

表7 各组大鼠粪便中菌群科水平相对丰度（%）变化（±s，n=8）

表7 各组大鼠粪便中菌群科水平相对丰度（%）变化（±s，n=8）

注：与正常组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

菌科 正常组 模型组Prevotellaceae 17.30±9.96 23.66±12.80 Ruminococcaceae 15.60±3.48 18.15±5.23 S24-7 16.09±4.52 21.41±7.42［Paraprevotellaceae］ 15.99±10.20 12.55±6.19 Lachnospiraceae 10.81±9.02 6.47±3.13 Veillonellaceae 9.65±5.45 6.06±1.69 Desulfovibrionaceae 6.04±3.40 1.80±1.25*Bacteroidaceae 3.78±2.60 3.33±1.17 Enterobacteriaceae 0.36±0.35 1.01±1.04 Porphyromonadaceae 0.78±0.65 0.76±0.84 Lactobacillaceae 0.51±0.29 0.74±0.34 Helicobacteraceae 0.22±0.17 1.16±0.90*#

3 讨论

ANIT是一种能造成胆汁淤积性肝炎的肝毒剂，被广泛用于急性肝内胆汁淤积相关的实验研究，动物一次性灌服该药物后可出现与人类胆汁淤积性肝炎相似的血清生化学及肝组织病理学改变，48h达疾病高峰，后肝功能逐渐恢复，为一种自限性过程，项目组前期研究也证实了这种现象［1］。该法主要优势为造模方便、成功率高。目前其具体作用机制仍未完全阐明。有研究表明，ANIT在体内可诱导肝细胞发生强烈的炎症反应，中性粒细胞被活化，释放大量的氧自由基［2］。ANIT所引起的脂质过氧化水平增加可能是导致胆汁淤积性肝炎病变发生的初始阶段，而病理学改变则是其后续阶段［3］。1998年，Marshall提出了“肠－肝轴”的概念，目前许多临床研究也已证实胆汁淤积时肠道菌群与发病密切相关。肝内胆汁淤积发生后，由肝脏分泌的胆汁无法顺利进入肠道，从而引起肝脏代谢功能紊乱，肝功能严重受损，肠道内缺乏胆汁酸盐，无法清洗肠道，加上免疫系统受抑制、肝肠轴功能受损等一系列病理改变均可导致肠道菌群失调，造成肠道菌群和脂多糖（LPS）移位，而肠道菌群失调可进一步加重胆汁淤积，胆汁淤积与肠道菌群失调可互为因果［4］。有临床研究发现胆汁淤积性肝病患儿大肠埃希菌数量较健康婴儿升高，而双歧杆菌、乳酸菌数量则低于健康婴儿［5］。但在实验研究方面，目前仍缺乏针对ANIT诱发的肝内胆汁淤积模型发病过程中肠道菌群变化的相关研究，这可能与该造模方法疾病高峰出现较早且为自限性，而许多肠道微生态研究需要一个亚急性或慢性发病模型相关。近年来欧巧群等［6］改良了上述模型，其使用ANIT间歇性多次减量灌胃成功建立了大鼠亚急性肝内胆汁淤积模型，其在用药4周内均维持了明显的肝内胆汁淤积，并出现了早期肝纤维化表现，这给ANIT法模型的肠道菌群研究创造了条件。本次研究参考以上经验，在ANIT减量灌胃1次/周后，生化检测提示23d内大鼠肝内胆汁淤积状态稳定持续，表明该法确能较好地建立亚急性肝内胆汁淤积大鼠模型。本实验16s rRNA高通量测序结果表明，ANIT干预后可使大鼠门、纲、科各水平肠道菌群的丰度明显降低，但对菌群的多样性影响相对较小，通过进一步对门、纲、科各水平的肠道菌群相对丰度分析显示模型组及正常组差异主要是在变形菌门内部结构比例上：模型组肠道中δ-变形菌纲中的脱硫弧菌科比例较正常组明显下降（P＜0.05），而ε-变形菌纲中的螺杆菌科比例较正常组则明显升高（P＜0.01）。变形菌门虽然在健康人群肠道和粪便中所占的比例较低，但其包含了诸多的病原菌和机会致病菌，该分类下的细菌多为革兰阴性杆菌，具有产生脂多糖的能力，胆汁淤积发生时，部分细菌在患者肠道中过度增殖可能导致肠黏膜炎症并增加肠屏障功能障碍的风险，从而进一步阻碍胆汁酸的肠肝循环加重胆汁淤积，形成恶性循环。故作者推测，肠道菌群丰度的明显下降以及肠道内变形菌门中脱硫弧菌和螺杆菌的相对丰度变化可能是ANIT诱发的大鼠肝内胆汁淤积的重要特征性变化。希望这一结果能为肝内胆汁淤积的肠道微生态动物实验研究提供必要的实验数据及理论依据，并有助于在今后开展进一步的深入研究。