食源性混合菌生物被膜的 形成和相互作用机制

,,,,,*

(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018; 2.内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头 014109)

近几年来,食源性疾病引起的食物中毒事件不断发生,食品安全问题受到了国内外广泛关注。据世界卫生组织(WHO)报道,每年食源性疾病高达30%。这些由病原菌引起的食品安全问题中,65%是因为病原菌形成生物被膜造成的[1]。细菌生物被膜(biofilm)是菌体为适应胁迫环境,粘附于物体或者人体组织表面,通过分泌大量的多糖、蛋白质和核酸等胞外基质将自身包裹在其中而形成的聚集膜样物[2]。生物被膜会形成牙菌斑等危及人类健康,还会对食品加工设备、加工厂地板和墙壁表面造成污染[3]。相较于单个的浮游细菌,生物被膜的形成会对抗生素和宿主免疫系统产生更强的抵抗力。因此,生物被膜形成机制的研究一直是国内外学者关注的重点领域[4]。

细菌生物被膜的研究一直集中于医学领域中,直到1988年Dodd等[5]从鸡肉加工厂的脱毛器械中发现了金黄色葡萄球菌生物被膜,并发现它们对抗菌剂有较强抵抗力,至此食源性病原菌生物被膜会造成食品腐败的问题被广泛关注。Herald等[6]使用扫描电子显微镜(SEM)研究了单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)于10、21、35 ℃下在不锈钢表面的附着程度,发现微生物细胞在三个温度下均可粘附,又进一步发现食品的加工地板、输送管道上极易形成单核细胞增多性李斯特氏菌生物被膜,给食品加工安全造成巨大隐患。Giaouris等[7]发现,在肉类加工过程中,潜在的致病菌会粘附在食物接触表面形成生物被膜,从而导致产品发生交叉污染、保质期降低等问题。随着不断的研究发现,不仅革兰氏阳性菌会形成生物被膜,大肠杆菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等食源性革兰氏阴性菌也会形成生物被膜。

食品加工环境中,病原菌的持续存在是造成食源性疾病发生的主要因素,并被认为对公共健康有重大影响。食品加工环境会为生物被膜的形成提供有利条件,例如水分、营养物质等。在这样的有利条件下,细菌可以粘附于食品接触表面繁殖并形成生物被膜,从而危及食品的质量和安全性[8]。目前,研究人员主要致力于单一菌种生物被膜的形成特性及抑制清除生物被膜方法的研究,对混合病原菌生物被膜的研究较少。但存在于自然界中的大多是多种病原菌形成的混合病原菌生物被膜,其结构成分更为复杂,抵抗外界不良环境能力加强,一旦达到成熟期很难被完全清除。因此,研究混合病原菌生物被膜的形成特性和菌间相互作用机制至关重要。

本文在现有的研究基础上,归纳总结了食源性混合菌生物被膜的形成规律及混合菌生物膜中菌种间的相互作用,初步探讨了群体感应在混合菌生物膜中的作用,以期为食品领域应对和破解食源性混合菌生物被膜污染问题提供启示。

1 生物被膜的形成

生物被膜的形成是一个动态且非常迅速的过程。与同种微生物的浮游状态相比,生物被膜的形成过程是十分复杂的。此过程会产生物理、化学、生物反应,细胞间会通过特殊类型的信号传递以及不同组基因的转录进行联系[9]。遗传学研究表明,形成混合菌生物被膜会经过五个阶段:第一阶段是细菌表面的特异性蛋白等物质选择性的粘附于物体表面而发生的可逆粘附,处于粘附期的细菌状态不稳定,因此可在此阶段及时进行清除[10]。第二阶段是细菌通过自身分泌的胞外聚合物或鞭毛介导而发生的不可逆粘附,通过静电作用产生的附着力不仅将微生物细胞附着于生物材料表面,还会加强生物膜内微生物细胞间的凝聚力[11]。第三阶段是发展期,通过胞外多糖内的特定化学信号分子,细菌群落不断聚集,使得生物被膜不断加厚,生物被膜中的细菌菌落通常是由多种类型的微生物群落组成的混合生物被膜,混合生物被膜的形成为不同微生物的相互依赖生长提供了良好环境[12]。第四阶段的微生物间会通过自体诱导物信号进行交流,并分泌大量胞外多聚糖,以形成高度有组织的成熟生物被膜,此阶段的生物被膜已达到稳定状态,对外界抵抗力达到最强,且最难以被清除[13]。第五阶段是混合生物被膜内的一部分微生物开始脱落,在脱落过程中,生物膜内的微生物会产生不同的糖分解酶,以帮助被释放的微生物重新粘附于物体表面形成新的生物被膜[14]。通过这五个阶段,微生物在混合生物被膜内完成了粘附、发展、成熟、脱落、重新粘附的循环过程。

2 生物膜内菌种间的相互作用

食品加工环境中的微生物种类繁多,且均可以在固体表面形成生物被膜。这种多样性使得它们之间以不同的相互作用关系构成了复杂的混合菌生物被膜。越来越多的研究表明,多物种生物被膜对抗生素的抵抗力要明显高于单一种类的抵抗力[21]。Van等[22]研究发现,单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)形成的混合生物被膜对苯扎氯铵和过乙酸的抗性要明显强于其单一菌的耐药性。因此,研究混合菌生物被膜形成特性及其种间相互作用关系尤为重要。根据学者们的研究可知,在食源性混合病原菌生物被膜中,菌种间的主要相互作用是共生和竞争。

2.1 共生作用

共生又叫互利共生,是多种生物相互分工合作,缺此失彼都不能生存的一类种间关系[23]。混合菌生物膜中的微生物间也存在共生作用,这种种间的相互促进作用会增强细菌对固体表面的附着力。Wang等[24]对食源性病原菌肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、血清型鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)和产志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli)O157∶H7形成的单种生物膜及其混合菌生物被膜进行研究发现,一是细菌生物被膜比浮游菌对消毒作用的抵抗力更强;二是具有负胞外多糖表达的沙门氏菌和大肠杆菌菌株形成的混合病原菌生物被膜比单菌株生物膜更具耐药性,表明细菌间的互利共生作用加强了生物膜的抵抗力。Zhang等[25]发现了铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的生长可以保证黄杆菌(Flavobacterium)进入混合菌生物被膜有利区域。Ibusquiza等[26]通过对不同情况下单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)形成的混合菌种生物膜与相应的单菌种生物膜微观结构进行比较得出,恶臭假单胞菌与单核细胞增多性李斯特氏菌的关联关系加速了生物被膜的形成。Kai等[27]通过荧光标记法发现,铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)形成的双菌种生物被膜与单种生物被膜空间结构和丰富度都不同。混合双菌种生物被膜对抗菌剂(十二烷基硫酸钠、抗坏血酸)均比单一菌种抵抗力强。至关重要的发现是,双菌种间的互利共生作用对生物被膜起到了保护作用,而不是某一单一菌的选择性抵抗力发挥作用。Sancbhezvizuete等[28]研究发现,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)能够保护金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)不受杀菌剂作用。在此双菌种生物膜中,枯草芽孢杆菌中的ypqP基因会增强生物被膜对杀菌剂的耐受性,以起到保护金黄色葡萄球菌的作用。Ren等[29]研究发现,嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)、黄单胞菌(Xanthomonas)、氧化微杆菌(Microbacteriumoxydans)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)四种菌在混合生物被膜中表现出超强的协调作用。在特定的体外环境中,只有黄单胞菌可以单独形成生物被膜。但由于协同效应,四种菌可共同形成混合菌生物被膜,且个体菌株数量明显高于单种生物被膜。由此可见,生物被膜内多菌株的共生作用可以促进胞外多糖等基质的产生聚集。基质凝聚力的加强不仅会增加生物膜内群落的多样性,还会增强菌株的粘附力,从而增强了生物膜的持久性和耐药性。

2.2 竞争作用

混合病原菌生物被膜内的微生物种间不仅存在互利共生作用,还存在竞争作用。竞争作用是指在营养物、最适生长环境等微生物生长的必需条件不足时,微生物间会发生争夺,或通过自身的快速生长繁殖,更快夺取营养物质。在混合菌生物被膜中,某一微生物可通过弱化其他病原菌的粘附能力来增强自身粘附率[30]。Millezi等[31]通过对聚丙烯表面的大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)形成的双种生物被膜的研究发现,双菌种生物膜中的大肠杆菌降低了金黄色葡萄球菌的易感性,使得双种生物膜中的金黄色葡萄球菌活细胞数量远远小于单种生物膜中金黄色葡萄球菌的活细胞数量。Wang等[32]发现,铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)会明显降低肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)的生长速率,对混合病原菌生物被膜中的肠道沙门氏菌有抑制作用。Rüger等[33]通过流式细胞术方法对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)形成的混合菌生物被膜进行了研究,发现铜绿假单胞菌在混合菌生物膜中的生长比其余两株菌更具优势,这种优势是通过铜绿假单胞菌的拮抗性使得洋葱伯克霍尔德菌和金黄色葡萄球菌的生长速率被抑制。Kuznetsova等[34]发现,铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)通过分泌体外代谢产物来抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)的生长繁殖,使得大肠杆菌在铜绿假单胞菌和大肠杆菌形成的混合菌生物被膜中的代谢率降低。Makovcova等[35]通过对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、潜在致病性和非致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)形成的单种和多种生物被膜生长率的研究可知,混合病原菌生物被膜中革兰氏阴性菌比在单种生物被膜中生长的更好,但是混合菌生物被膜中的金黄色葡萄球菌菌群要明显小于单种生物被膜中的金黄色葡萄球菌菌群。总而言之,混合菌生物被膜内的某一微生物会分泌可抑制其余微生物生长繁殖的代谢产物,或者利用自身生长优势掠夺营养物质以弱化其它微生物的粘附力,从而在混合菌生物被膜中占据优势。

3 群体感应机制

生物电化学系统(BESs)是用于电能生产、环境修复以及微生物代谢反应的前沿技术,其含有的化学活性微生物(EAMs)的电活性生物膜(EAB)可以通过各种电子传递方式与电极交换电子[36]。通常EAM通过三种方式向电极供电:地杆菌属(Geobacteraceae)和希瓦氏菌属(Shewanella)通过外膜细胞色素直接转移电子;铁呼吸菌属(Ironrespiratoryfungus)是沿着模式生物体的导电菌毛直接传输电子;希瓦氏菌(Shewanella)释放的抗体和由铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)产生的吩嗪通过自我合成的氧化还原介体间接转移电子[37]。研究表明外部或内源性群体感应(QS)信号分子对电活性生物膜(EAB)有直接影响。

1994年Fuqua等[38]首次提出群体感应概念,Alexander等[39]于1965年在肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)中发现了第一个群体感应信号分子,至此群体感应系统被提出。群体感应(quorum sensing,QS)是一种广泛存在于微生物细胞间的通讯机制。微生物通过分泌和响应特定的物理、化学信号分子来启动细胞运动、化学生物合成和生物膜形成等行为[40]。QS可使细菌细胞间进行交流并协调他们的活动,因此,群体感应在食源性混合病原菌生物被膜的建立和发展中起着至关重要的作用。

3.1 AHLs介导的群体感应系统

N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)是革兰氏阴性菌最常见的QS信号分子。当微生物处于指数生长期时,自体诱导物分子(AI-1)会通过细胞膜运输至微生物细胞外进行介导[41]。Yeon等[42]发现了群体感应淬灭现象,这种现象是因酰基转移酶对高丝氨酸内酯和AHL酰基链之间的酰胺键造成不可逆地破坏,从而阻断了信号通路。这一发现已被应用于解决污水处理中的生物膜污染问题。

3.2 AIPs介导的群体感应系统

革兰氏阳性细菌中主要存在的自诱导物是寡肽(AIPs),寡肽自诱导物是从前体细胞加工修饰所得。AIPs具有高度特异性,它通过激活DNA结合蛋白的方式来调控靶基因的转录。Quadri等[43]发现,革兰氏阳性细菌通常利用氨基酸和短肽来进行细胞间的基因调节。Miller等[44]进一步研究发现,AIPs介导的群体感应通常发生在微生物种内或菌种之间,且寡肽自诱导物会使宿主发生特异反应。

3.3 AI-2介导的群体感应系统

自体诱导物分子AI-2首次被发现于哈氏弧菌属中,Bassler等[45]发现,哈氏弧菌中不仅存在AI-1信号分子,还存在另一种可进行种间交流的AI-2信号分子,它广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中,并可介导不同菌属微生物间的相互交流。Ng等[46]证实,AI-2信号分子的合成与LuxS基因相关,一旦LuxS基因失活,AI-2信号分子将不会产生。

4 结论与展望

食源性病原菌生物被膜的形成特性和抑制方法已经受到食品领域专家的广泛关注,并已取得了较大进展,但目前对于混合病原菌生物被膜的研究较少。由于食源性混合病原菌形成的生物被膜结构复杂且耐药性更强,难以被抗生素等抑菌剂杀灭清除,因此,探究混合病原菌生物被膜的形成和相互作用机制尤为重要。混合菌生物被膜中的细菌菌落通常是由多种类型的微生物群落组成,它们之间的相互协调作用和分泌胞外多糖的能力在底物交换、重要代谢产物的分布和代谢终产物的排泄中起着至关重要的作用。因此通过控制外部环境条件以及营养成分等因素可以改变微生物的产糖能力,从而控制混合病原菌生物被膜的形成。此外,混合菌生物被膜间存在群体感应系统,探究群体感应信号分子的调控机制,是控制食源性混合病原菌生物被膜污染问题的突破口之一。