黄秋葵叶茶营养及挥发性成分分析

, ,,

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058)

黄秋葵(Abelmoschusesculentus(L.)Moench),别名秋葵、羊角豆、女人指,主要种植在热带和亚热带地区,它是一种药食同源的新型蔬菜,其嫩果荚是主要的食用部位,富含膳食纤维、矿物质、维生素及多糖等营养物质[1-2],具有降血糖[2]、免疫调节[3]、降血脂[4]、抗抑郁[5]、抗肿瘤[6]等多种保健功能。目前,对黄秋葵的研究主要集中在其果荚、种子和花上,但由于其叶也具有一定的营养和药用价值,因此对其叶的研究也正在逐步深入。

黄秋葵嫩叶可以像菠菜一样被烹饪食用,且可入药,也可作为利尿剂、胃溃疡药和伤口愈合药等[7],《云南中草药选》记载:“治骨折,跌打损伤”,《贵州草药》记载:“消肿止痛,治疮疽”[8]。黄秋葵叶的营养价值较为丰富,最初对黄秋葵叶的研究主要集中在营养成分的测定,Camciuc等[7]测定了不同品种黄秋葵的基本成分,发现在黄秋葵叶中,纤维素平均含量为8.59%,蛋白质平均含量为22.74%;Boukari等[9]测定黄秋葵叶中钙含量为2850 mg/100 g;Nwachukwu等[10]对黄秋葵叶成分进行了较全面地分析,其中多酚含量为9.9 mg/g,黄酮含量为8 mg/g;罗燕春等[11]对黄秋葵叶中叶黄素和β-胡萝卜素稳定性进行了研究,发现光会导致两者降解,而维生素C有利于两者的稳定,经0.24%维生素C处理的叶黄素和β-胡萝卜素含量分别达到20.51和10.97 mg/100 g;靳银杰[12]从黄秋葵叶中分离纯化并鉴定出9种物质,包括胡萝卜苷、羽扇豆醇、色氨酸、槲皮素、β-谷甾醇等。白石琦[13]将黄秋葵叶多糖进行分离纯化,发现其具有较好的抗氧化活性。总的来看,目前黄秋葵叶的研究主要集中在品质分析、活性成分提取及功能评价方面,而鲜有对黄秋葵叶加工及其产品分析方面的报道。

因此,本文以黄秋葵鲜叶为原料,参照工厂绿茶工艺制成黄秋葵叶茶,并对其营养及挥发性成分进行分析,旨在全面了解黄秋葵叶茶品质特征,掌握黄秋葵叶茶的营养价值,为后续的研究开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄秋葵鲜叶 于2017年10月采摘于浙江嘉善;无水乙醇、苯酚、氯化铝、乙酸钾、水合茚三酮、无水碳酸钠、5-磺基水杨酸等为分析纯,浓硫酸等为优级纯,谷氨酸、福林酚为生化试剂 国药集团化学试剂有限公司;氯化亚锡、2,6-二氯靛酚钠盐等为分析纯,乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚等为色谱纯,纤维素酶(10000 U/g,来源于黑曲霉)、芦丁标准品、没食子酸标准品 阿拉丁试剂有限公司;β-胡萝卜素标准品 上海源叶生物科技有限公司;叶黄素标准品 上海信裕生物科技有限公司;咖啡碱标准品 上海士峰生物科技有限公司。

6CCB-881ZD型全自动扁形茶炒制机 浙江新昌县均一机械有限公司;6CCT-50型滚筒炒干机 浙江新昌县均一机械有限公司;YMC carotenoid(250×4.6 mm,5 μm)色谱柱 YMC公司;预柱(30 mm×4.6 mm,5 μm),安捷伦公司;SRJX-4-13D型马弗炉 上海和呈仪器制造有限公司;HE53/02型水分测定仪 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;k9890型全自动凯式定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;Waterse2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司;UV-2550型紫外可见分光光度计 日本Shmadzu公司;VELPRaw Fiber Extractor型纤维素测定仪 意大利Velp公司;7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;NexION 300XX等离子体质谱仪 美国Perkin Elmer公司;AA800型原子吸收分光光度计 美国PE(铂金-埃尔默)公司;L8900型氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄秋葵叶茶制备 黄秋葵鲜叶采摘后,置阴凉干燥通风处摊晾9～12 h,切条(长度任意),置于全自动扁形茶炒制机中,200～230 ℃杀青6.5 min,摊晾0.5～1 h,110 ℃下辉锅40～60 min,得黄秋葵叶茶成品,经超离心粉碎机粉碎后置于-20 ℃贮藏,备用。

1.2.2 主要营养成分的测定方法 采用水分测定仪测定水分,采用自动凯式定氮仪法(GB/T 5009.5-2016)测定粗蛋白的含量,采用索氏提取法(GB/T 5009.6-2016)测定粗脂肪含量,采用高温灼烧法(GB/T 5009.4-2016)测定灰分含量,采用称量茶渣差数法(GB/T 8305-2013)测定水浸出物量,采用Weende法[14]测定粗纤维含量,采用茚三酮比色法(GB/T 8314-2013)测定游离氨基酸含量,采用福林酚比色法(GB/T 8313-2008)测定多酚含量,采用分光光度计法(NY/T 1295-2007)测定黄酮含量,采用2,6-二氯靛酚滴定法(GB/T 5009.86-2016)测定维生素C含量,采用HPLC法(GB/T 8312-2013)测定咖啡碱的含量,并略作改动,参照王学奎等[15]测定叶绿体色素含量的方法测定类胡萝卜素总量,并略作改动。

1.2.3 总糖和多糖含量测定 参照宋思圆等[16]的提取方法,并略作改动。准确称取黄秋葵叶茶粉1 g(精确至0.001 g),使用纤维素酶(10000 U/g),加酶量1.5%,用柠檬酸缓冲液(pH=4.8)作为溶剂,料液比1∶40,在50 ℃下水浴提取3 h,4 ℃以4000 r/min离心20 min,收集上清液,用柠檬酸缓冲液定容至50 mL,适当稀释后,采用苯酚-硫酸法(GB/T 15672-2009)测定总糖含量;将收集的上清液加入4倍体积的无水乙醇,4 ℃醇沉过夜,然后4 ℃以4000 r/min离心15 min,沉淀用水复溶,定容至100 mL,适当稀释后,采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.2.4 矿物质含量测定 参照Jabeen等[17]的方法,并略作改动。准确称取0.2 g(精确至0.001 g)茶粉于消化管中,加入7 mL浓硝酸,室温静置过夜,向消化管中加入0.5 mL高氯酸。放入消解仪中,先加热到120 ℃预消解1 h,再加热到200 ℃消解,直至获得透明无浑浊的液体。当液体体积加热至1 mL左右时,冷却,将液体转移至50 mL容量瓶中,加入超纯水,定容至刻度。将定容后的消解液过0.22 μm滤膜后,分别测定钾(K)、钠(Na)、钙(Ca)、铁(Fe)、锌(Zn)、锰(Mn)、镁(Mg)、和硒(Se)8种元素的含量。

1.2.5 游离氨基酸种类及含量测定 准确称取烘至恒重的茶粉1 g(精确至0.001 g)于锥形瓶中,加入100 mL沸水,浸提45 min,取其中1 mL加入5-磺基水杨酸(2%～5%)1 mL,4 ℃以8000 r/min离心6 min,取上清液,用0.22 μm滤膜过滤,取1～1.5 mL至进样瓶中,用氨基酸分析仪测定。

1.2.6 叶黄素和β-胡萝卜素含量测定

1.2.6.1 样品处理 准确称取烘至恒重的茶粉2 g(精确至0.001 g),加入10 mL正己烷,完全混匀后37 ℃提取30 min,重复3次,取上清液混合后用正己烷定容至50 mL,适当稀释后,通过0.22 μm滤膜,用高效液相色谱仪测定,检测结果以mg/100 g DW表示。

1.2.6.2 HPLC条件 试验中使用色谱柱:YMC carotenoid(250 mm×4.6 mm,5 μm),预柱(30 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为甲醇∶MTBE∶水=82∶15∶3,B相为甲醇∶MTBE∶水=7∶90∶3,梯度洗脱:0～50 min,0～35% B,流速为0.7 mL/min,柱温为25 ℃,进样体积10 μL,检测波长设置为450 nm。

1.2.6.3 叶黄素和β-胡萝卜素标准曲线的绘制 分别称取10 mg叶黄素和β-胡萝卜素标准样品,用甲基叔丁基醚分别配制成质量浓度为1 mg/mL的单标母液,然后用甲基叔丁基醚稀释成浓度分别为1、5、10、50、100 μg/mL的混合标准溶液,通过0.22 μm滤膜,用高效液相色谱仪测定。以峰面积为纵坐标(y),标准溶液浓度(μg/mL)为横坐标(x),绘制标准曲线并进行线性回归分析,得到叶黄素的标准曲线为y=119794x+172472(R2=0.9997),β-胡萝卜素的标准曲线为y=233720x - 149637(R2=0.9998),结果表明,叶黄素和β-胡萝卜素含量在1～100 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

1.2.7 挥发性成分分析

1.2.7.1 HS-SPME 准确称取2.000 g黄秋葵叶茶样品均匀粉末,置于20 mL样品瓶中,在60 ℃水浴条件下静置10 min,顶空达到平衡后,插入装有50/30 μm DVB/CAR/PDMS型SPME装置,并推出萃取头吸附黄秋葵叶茶中的挥发性物质,保持时间为30 min,然后快速取出,插入GC-MS进样口,250 ℃解吸附3 min。

1.2.7.2 GC-MS条件 色谱柱:DB-5毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),柱温40 ℃;载气为He,流速1.5 mL/min。色谱条件:进样口温度250 ℃,不分流;升温程序:起始温度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升温至150 ℃,再以10 ℃/min升温至250 ℃,保持3 min。

质谱条件:电离方式为EI;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃,接口温度250 ℃;灯丝电流150 μA;扫描质量范围为30～500 amu。

1.2.7.3 定性定量方法 各组分质谱通过计算机在NIST 11谱库匹配及相关文献分析,确定化合物种类,采用面积归一化法得到各组分的相对含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 主要营养成分分析

对获得的黄秋葵叶茶的水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分、粗纤维、可溶性总糖、多糖、多酚、游离氨基酸、黄酮、维生素C、咖啡碱、类胡萝卜素、叶黄素和β-胡萝卜素进行了测定,结果见表1。茶叶的含水量影响茶叶的贮存和运输,参照国家标准《GB/T 14456.1-2017绿茶》[18]中的规定,其要求炒青绿茶含水量低于7.0%,而黄秋葵叶茶中水分含量为5.01%,说明其符合国家标准。黄秋葵叶茶中粗蛋白含量高达25.92%,说明其可作为一种优质的蛋白质来源。黄秋葵叶茶的粗脂肪含量为5.22%,一定含量的游离脂肪酸能够为茶汤提供陈味感[19]。白石琦[13]研究发现黄秋葵叶中含有亚麻酸等不饱和脂肪酸,具有很好保健功能,而且α-亚麻酸可以作为六到十碳香气物质的前体,为茶叶提供清新香气[20]。灰分是茶叶的品质指标,国标中规定总灰分含量不超过7.5%[18],而黄秋葵叶茶总灰分含量为14.77%,高于国家标准,这可能是黄秋葵叶茶与绿茶品种存在差异导致的。粗纤维含量与茶叶品质呈负相关,可作为评定茶叶老嫩的指标之一[19],国标中规定粗纤维含量不超过16%[18],而黄秋葵叶茶粗纤维含量为10.99%,符合国家标准。

表1 黄秋葵叶茶中主要营养成分分析Table 1 Contents of some nutritional components of okra leaf tea

水浸出物是茶叶中能溶于热水的可溶性物质,其含量体现茶叶内含物质的多少,决定了茶汤的色泽、浓淡和口感,与茶叶品质成正相关[19,21],国标中规定其含量应大于34%[18],而黄秋葵叶茶中的水浸出物含量为46.12%,符合国家标准。可溶性总糖含量为11.41%,高于一般绿茶,它参与茶叶香气的形成,同时为茶汤提供甜醇味,增加茶汤浓度[19-20]。而多糖含量为3.56%,研究发现,茶叶多糖具有多种生理活性[22],而白石琦[13]对黄秋葵叶多糖进行研究发现其具有较好的体外抗氧化活性,多糖的存在进一步增加黄秋葵叶茶的营养价值。茶多酚是评价茶叶品质的重要指标,绿茶中的茶多酚含量为18%～30%[19],而黄秋葵叶茶的多酚含量仅为1.47%,但黄秋葵叶茶的多酚含量与桑叶茶(0.99%)[23]、薄荷叶茶(1.30%)[24]等较为接近,低于荷叶茶(5.21%)[25]。虽然较低的多酚含量会影响黄秋葵叶茶的营养价值,但却大大降低了茶汤的苦涩感。游离氨基酸对茶汤鲜味的贡献率达到70%[26],同时,其对茶叶香气的形成也起着重要作用,绿茶中游离氨基酸含量为3%～4%[27],黄秋葵叶茶游离氨基酸含量为1.70%,稍低于绿茶。黄酮类物质为茶汤提供苦涩味,其含量与绿茶滋味品质相关性较小,但对茶叶的营养价值贡献较大。黄秋葵叶茶的黄酮含量为1.18%,稍高于桑叶茶(0.69%)[23]、薄荷叶茶(0.47%)[24],低于荷叶茶(3.10%)[25]。总体而言,由于多酚含量较低,游离氨基酸含量相对较高,酚氨比较低,因此,黄秋葵叶茶茶汤苦味淡而鲜爽,说明黄秋葵叶茶具有较大的开发潜力。

茶叶中的酸味成分大部分是茶鲜叶中固有的[19],如维生素C,虽然在加工过程中会损失部分维生素C,但在加工完成的黄秋葵叶茶中仍有维生素C的存在,经测定其含量为(24.17±0.43) mg/100 g。维生素C一方面可以增加黄秋葵叶茶营养价值,另一方面也进一步丰富了茶汤滋味。咖啡碱是茶叶中主要的生物碱之一,主要为茶汤提供苦味,但它与多酚类及其氧化产物形成络合物后,就会减轻茶汤的苦涩味[21,27]。绿茶中的咖啡碱含量为3%～4%[27]。王萍等[28]研究表明,黄秋葵及其不同组织部位均不含咖啡碱,这与美国国家营养数据库(USDA)一致,但黄阿根等[29]研究却发现黄秋葵种子中的咖啡碱含量达到1%左右。本文采用HPLC法对黄秋葵叶茶中的咖啡碱进行测定,发现黄秋葵叶茶中含有咖啡碱,且含量为(6.43±0.28) mg/100 g。由于其咖啡碱含量较低,可以随时饮用黄秋葵叶茶而不会影响正常休息。

黄秋葵叶中的类胡萝卜素一直是人们研究的重点,但人们将更多的关注点放在了其对于禽蛋的着色上面。实际上,类胡萝卜素的存在对于黄秋葵叶茶的加工而言意义重大。类胡萝卜素一方面能够影响茶叶色泽,另一方面可以作为挥发性香气的前体物质,其通过氧化降解和裂解反应生成一系列具有香甜花香的物质[27],如由β-胡萝卜素可生成β-紫罗酮,由叶黄素可生成萜类醛酮等[20]。采用王学奎等[15]所述公式计算出黄秋葵叶茶中类胡萝卜素总量为(153.42±4.60) mg/100 g,采用HPLC法对其中的叶黄素和β-胡萝卜素进行分析,发现叶黄素含量为(97.44±3.02) mg/100 g,β-胡萝卜素含量为(29.06±0.67) mg/100 g,叶黄素含量明显高于β-胡萝卜素,且前者为后者的3倍多。

2.2 矿物质元素

茶叶中富含全部人体所需的矿物质,其中有50%～60%在热水冲泡时溶于茶汤中,而且茶叶中的矿物质大多以有机态存在,有利于人体吸收。经常饮用茶可满足人体对一些矿物质元素的需求[30-31]。因此测定矿物质含量对于判定茶叶品质十分重要。采用ICP-MS和原子吸收法测定了黄秋葵叶茶中8种矿物质含量,结果见表2。一般绿茶中矿物质元素含量较高的有钾、钙、钠、镁[32]。而黄秋葵叶茶也与之相似,其含量最高的矿物质元素为钾,达到1754.13 mg/100 g,钠含量为79.93 mg/100 g,黄秋葵叶茶的钾钠比约为22∶1,而高钾钠比的食物恰恰满足人体需求,有益于健康。钙含量为621.12 mg/100 g,高于一般绿茶(188.6～375.6 mg/100 g)[32],镁含量为71.48 mg/100 g,低于一般绿茶(149.4～210.4 mg/100 g)[32]。而另外四种矿物质元素锰、铁、锌、硒含量较低,尤其是硒含量仅为0.01 mg/100 g。这些结果表明,通过饮用黄秋葵叶茶能够为人体补充一定量的矿物质元素。

表2 黄秋葵叶茶中矿物质元素含量Table 2 Contents of mineral substance of okra leaf tea

2.3 游离氨基酸种类及含量

每一种游离氨基酸都能够为茶汤提供独特的滋味,包括甜、酸、苦、鲜味等,它们彼此之间有协同增效的作用,同时也可以与茶汤中的其它物质形成络合物,进而赋予茶汤鲜爽滋味[19]。此外,游离氨基酸(如L-精氨酸)还可与糖发生美拉德反应,进而生成呋喃、吡嗪和吡咯等物质,为茶叶提供烘烤香气[27]。黄秋葵叶茶中游离氨基酸的分析结果见表3。结果表明,黄秋葵叶茶中含量较高的游离氨基酸为γ-氨基丁酸、谷氨酸、苏氨酸和天冬氨酸,且γ-氨基丁酸和谷氨酸阈值相对较低,故两者的滋味占主导。其中γ-氨基丁酸的含量高达250.34 mg/100 g,此前并未有研究报道过黄秋葵叶茶中含有γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸是一种受到广泛关注的非蛋白质氨基酸,其在脑中浓度较高,在中枢神经系统中作为抑制性神经递质而发挥作用[33]。γ-氨基丁酸具有多种生理功能,如稳定情绪、预防糖尿病和癌症等,尤其在降血压方面具有显著效果[33]。因此,饮用黄秋葵叶茶对人体有极大的益处。

表3 黄秋葵叶茶中游离氨基酸含量Table 3 Contents of free amino acid of okra leaf tea

2.4 挥发性成分分析

茶叶挥发性香气成分含量虽然微乎其微,但其对于茶叶品质影响较大,迄今为止,已鉴定的茶叶香气物质超过600种,它们可分为15大类[19]。茶叶香气物质一部分来自于茶鲜叶本身,一部分来自于加工过程。研究发现,这些香气物质主要由4个途径产生,分别是以类胡萝卜素、脂类和糖苷类物质作为前体经一系列变化而形成,或经美拉德反应而产生[20],而不同的香气成分组合起来会赋予茶叶独特的风味。因此,分析黄秋葵叶茶的挥发性香气成分对于评价其品质至关重要。

采用SPME提取后,对黄秋葵叶茶进行GC-MS分析,其总离子流图见图1,黄秋葵叶茶挥发性成分分析结果见表4。

表4 黄秋葵叶茶中挥发性成分分析Table 4 Analysis of volatile components of okra leaf tea

图1 黄秋葵叶茶挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of okra leaf tea

由表5可知,从黄秋葵叶茶中共分离鉴定出28种挥发性成分,主要包括醛类12种,醇类2种,酮类2种,酯类1种,烷烃类4种,烯烃类2种,芳香烃类3种,其他2种。醛类化合物是黄秋葵叶茶挥发性物质的主要成分之一,占挥发性物质总含量的47.53%,它们大部分以不饱和脂肪酸,如α-亚麻酸、亚油酸、油酸及棕榈酸等作为前体物质[20],其中青叶醛(4.27%)、己醛(7.35%)能够为黄秋葵叶茶提供青草香;β-环柠檬醛(1.81%)是类胡萝卜素氧化降解产物,属于萜类化合物,具有水果清香;而由亮氨酸氧化后生成的异戊醛(3.72%),苯丙氨酸氧化后生成的苯乙醛(1.92%),以及庚醛(2.19%)、苯甲醛(5.72%)、壬醛(5.27%)等都被认为是使茶叶具有栗子香的关键香气成分[36],所以醛类化合物对黄秋葵叶茶的香气贡献较大。醇类化合物相对较少,仅占挥发性物质总含量的3.92%,其中顺-2-戊烯-1-醇(2.58%)也能够提供绿叶清香。酮类化合物虽然仅占挥发性物质总含量的1.90%,但其对于黄秋葵叶茶的香气意义重大。香叶基丙酮的相对含量为0.89%,其具有玫瑰花香,能够使香气更加圆润[37];而β-紫罗酮的相对含量为1.01%,它是绿茶的典型香气成分之一,由β-胡萝卜素降解而产生,具有紫罗兰香且阈值较低(在水中0.007 ppb)[20],对黄秋葵叶茶香气贡献较大。仅检测到1种酯类物质是二氢猕猴桃内酯,其相对含量为0.55%,它是红茶的特征香气成分之一,由β-胡萝卜素经酶促氧化而产生[20],具有水果清香。烷烃类化合物占挥发性物质总含量的8.47%,其一般无气味或气味微弱[38],对黄秋葵叶茶香气贡献较小。烯烃类化合物占挥发性物质总含量的10.35%,其中D-柠檬烯(6.93%)相对含量较高,它属于萜烯类化合物,具有薄荷清香。侯鹏娟等[39]对黄秋葵籽中挥发性成分进行分析,发现其中也含有D-柠檬烯、香茅烯等带有花香和木香气息的萜烯类化合物。芳香烃类化合物占挥发性物质总含量的5.79%,其中对二甲苯(2.24%)和邻伞花烃(0.67%)也有一定的助香作用。含硫化合物二甲基硫醚是新茶的香气成分,其相对含量高达17.02%,它的形成与甲硫氨酸密切相关[20],被认为是绿茶清香的原由[19],故推测其可能是黄秋葵叶茶特征香气成分之一。吡嗪类化合物2,6-二甲基吡嗪是典型的美拉德反应产物,其相对含量为1.47%,能够为黄秋葵叶茶提供焦糖香和烘烤香。

总体而言,黄秋葵叶茶具有多种绿茶特征香气成分,能够赋予黄秋葵叶茶独特的香气特征。而它们对于黄秋葵叶茶香气的贡献程度还需通过气味活性值(OAV)及GC-O等进行进一步表征。

3 结论

黄秋葵鲜叶参照绿茶工艺制成茶后,经测定其中含有较多的营养成分,粗蛋白占25.92%、游离氨基酸占1.70%、多糖占3.56%、多酚占1.47%、黄酮占1.18%、钾1754.13 mg/100 g、钙621.12 mg/100 g、类胡萝卜素153.42 mg/100 g、叶黄素97.44 mg/100 g和β-胡萝卜素29.06 mg/100 g。此外,还含有γ-氨基丁酸250.34 mg/100 g和咖啡碱6.43 mg/100 g。从黄秋葵叶茶中共分离鉴定出28种挥发性成分,其中醛类物质含量最高,占挥发性化合物的47.53%,对黄秋葵叶茶的香气贡献较大;二甲基硫醚(17.02%)、己醛(7.35%)、D-柠檬烯(6.93%)、β-环柠檬醛(1.81%)和β-紫罗酮(1.01%)等是其主要香气物质,它们共同赋予黄秋葵叶茶独特的香气。

本研究表明,黄秋葵叶茶含有丰富的营养成分,具有较高的营养价值,同时含有大量挥发性物质,能够形成黄秋葵叶茶独特的风味。因此,将其作为新型茶叶进行开发,一方面能够有效避免黄秋葵叶资源的浪费,充分发挥其价值;另一方面在丰富茶叶资源,满足人们对于营养与健康的需求方面具有现实意义。