SASH1是乳腺癌预后的一个新的生物标志物

詹钦文,李 述,王 科,李 波*

(1重庆医科大学附属永川医院骨科,重庆 402160;2重庆医科大学附属永川医院检验科;*通讯作者,E-mail:cqeylibo@163.com)

乳腺癌是世界上女性癌症相关死亡的第二大常见原因[1,2]。2012年全世界妇女中发生了大约170万新发乳腺癌[2]。在2016年,美国大约有246 660例新发侵袭性乳腺癌病例,包括61 000例原位癌,其中有40 450例患者死亡[3]。乳腺癌也是中国大陆女性最常见的癌症,发病率为268.6/100 000人,每年增加3.9%左右[4]。

SASH1作为SH3/SAM连接分子家族成员,已被鉴定是信号转导过程中的一个新的肿瘤抑制因子和关键蛋白[5]。Ren等[6]报道,SASH1表达下调会抑制卵巢癌的生长、增殖和迁移,增强细胞凋亡。最近,Burgess等[7]报道SASH1对乳腺癌的进展具有亚型依赖性影响,并且与其预后相关。通过氯吡嗪处理恢复乳腺癌细胞SASH1蛋白的表达似乎会增加乳腺癌细胞的凋亡,这提示其可以作为乳腺癌治疗的潜在生物靶点。此外,与正常乳腺上皮组织相比,74%的乳腺肿瘤组织中SASH1的表达明显下降[8]。

微阵列技术的发展彻底改变了RNA和DNA的研究模式,并且已成为生物学和生物医学研究的重要组成部分[9]。通过检索Pubmed等数据库发现,目前关于SASH1的研究很少,特别是SASH1与乳腺癌预后关系的研究更少。因此,本研究通过生物信息学分析和免疫组织化学实验,对乳腺癌患者中SASH1的表达和突变进行了深入的探讨,以确定其在乳腺癌患者中的表达模式、潜在功能和预后价值。

1 材料和方法

1.1 Oncomine分析

Oncomine基因表达数据库(www.oncomine.org)是一个在线癌症微阵列数据库,主要用于分析不同肿瘤中SASH1的转录水平。将临床肿瘤标本中SASH1 mRNA表达水平与正常对照组中的mRNA表达水平进行比较,使用Students’t检验生成P值。P值和fold change值的界限值分别定义为P<0.05和fold change>2。

1.2 Breast cancer gene-expression miner v4.0 分析

Breast cancer gene-expression miner v4.0(bcGenExMiner v4.0)由36个带注释的基因组数据集和3个统计挖掘函数组成。表达模块于2016年3月29日添加,这个数据库主要通过临床病理参数来比较靶基因的表达水平,如激素受体、淋巴结状态等。预后模块评估了候选基因对乳腺癌患者中预后的影响,并为乳腺癌的治疗提供了潜在的预后标志物。

1.3 免疫组织化学法分析乳腺癌组织中SASH1表达水平及其与临床病理参数的关系

选取2016-05～2018-06重庆医科大学附属永川医院收治的80例乳腺癌患者手术切除组织标本和29例癌旁正常组织,均通过病理检测确诊。

将乳腺癌患者肿瘤组织和癌旁正常组织固定于10%甲醛溶液中(4 ℃,24 h)。石蜡包埋后切成5 μm厚的切片。然后于56 ℃烘箱过夜、二甲苯和梯度乙醇溶液脱蜡水化。抗原修复后滴加3% H2O2去离子水覆盖组织15 min,试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)室温封闭30 min,然后滴加兔抗人SASH1多克隆抗体(稀释比例为1 ∶50,购自美国Novus公司)37 ℃反应1 h,4 ℃过夜。滴加试剂B(生物素标记的即用型山羊抗兔IgG)37 ℃反应30 min。滴加试剂C(辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液)37 ℃反应15 min,DAB显色(免疫组织化学实验检测试剂盒购自无锡傲锐东源生物科技有限公司)。在显微镜下观察染色结果,并用PBS终止反应。苏木精对比染色,45 ℃ ddH2O浸泡返蓝。最后用中性树脂封固,在显微镜下观察阳性结果并拍照。根据肿瘤细胞染色强度评分,共4级:0分(-),1分(+),2分(++),3分(+++)。

1.4 The Kaplan-Meier Plotter分析

使用在线数据库Kaplan-Meier Plotter(www.kmplot.com)评估SASH1 mRNA表达水平对乳腺癌患者预后的价值,其中包含3 951名临床乳腺癌患者的基因表达数据和生存相关的信息。为了分析乳腺癌患者的无复发生存时间(recurrence-free survival,RFS)和总体生存时间(overall survival,OS),通过中位表达水平(高表达与低表达)将患者样本分成两组,并通过Kaplan-Meier生存图评估风险比(HR)、95%置信区间(95%CI)和log-rankP值。

1.5 TCGA data and cBioPortal分析

癌基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)包括30种不同肿瘤的测序和病理学数据结果。选取1 105例有病理报告的The breast invasive carcinoma(TCGA,Provisional)数据集,进一步通过cBioPortal分析SASH1突变情况。基因组谱包括来自GISTIC的突变和拷贝数变异(copy-number variance,CNV),mRNA表达z-分数(RNA Seq V2 RSEM)和蛋白质表达z分数(CPTAC)。同时根据cBioPortal的Kaplan-Meier生存曲线计算SASH1突变的总体生存时间和无病生存时间(disease-free survival,DFS)。

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件对各实验结果进行统计分析。分析乳腺癌组织的免疫组织化学检测结果以及SASH1表达与乳腺癌临床指标的关系时用χ2检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SASH1在乳腺癌病人中转录水平

使用Oncomine数据库对肿瘤中SASH1的转录水平与正常样本中的转录水平进行比较,发现其中18个数据集的乳腺癌患者的SASH1 mRNA表达明显下降,仅在1个数据集中SASH1 mRNA表达上调(Finak Breast数据集的浸润性乳腺癌)(见图1)。在Curtis Breast数据集,与正常样本相比,在所有类型的乳腺癌中均发现SASH1的低表达,且差异有统计学意义(P<0.05)。浸润性导管乳腺癌的差异倍数为-2.980,浸润性小叶乳腺癌的差异倍数为-2.480,浸润性导管和浸润性小叶乳腺癌的差异倍数为-2.709,管状乳腺癌的差异倍数为-2.537,粘液性乳腺癌的差异倍数为-2.948,髓样乳腺癌的差异倍数为-3.255和乳腺导管原位癌的差异倍数为-2.149(见表1)。

2.2 乳腺癌患者SASH1 mRNA水平和临床病理参数的关系

在bc-GenExMiner v4.0在线数据库中,根据不同的临床病理学参数,比较乳腺癌患者中SASH1 mRNA的表达差异。以51岁为界限,将病人分成两组,结果发现大于51岁的患者的SASH1 mRNA表达明显上调(P<0.001)。同时,以40岁和70岁为界限,将病人分为三组(<40岁,40-70岁和>70岁),结果发现大于70岁的老年患者的SASH1 mRNA表达上调(P<0.001)。以Her2受体阴阳性为界限,分析结果发现Her2阳性的患者的SASH1 mRNA表达上调(P=0.028)。而分别以雌激素受体和孕激素受体阴阳性以及结节状态为界限,发现SASH1 mRNA的表达差异无统计学意义(P值分别为0.314,0.171和0.377,见图2)。

该图由Oncomine生成,表明了差异有统计学意义(P<0.05)的mRNA的过表达(红色)或下调(蓝色)的数据集的数量图1 SASH1在不同肿瘤中的转录水平Figure 1 The transcription levels of SASH1 in different types of cancers

三阴乳腺癌是一种雌激素受体、孕激素受体和Her2受体均阴性的乳腺癌,本研究发现三阴乳腺癌与非三阴乳腺癌患者的SASH1 mRNA的表达差异无统计学意义(P=0.273)。在斯卡夫布鲁姆和理查森等级状态(Scarff Bloom & Richardson grade status,SBR)的病理分级中,我们发现,SBR等级越低的患者SASH1 mRNA表达水平越高(SBR1>SBR2>SBR3),且差异有统计学意义(P<0.001,见图2)。

表1不同类型的乳腺癌和乳腺正常组织之间SASH1表达在转录水平上的显著变化(ONCOMINE数据库)

Table1ThesignificantchangesofSASH1expressionintranscriptionlevelbetweendifferenttypesofbreastcancerandnormalbreasttissues(ONCOMINEdatabase)

SASH1表达类型 乳腺癌vs正常组织差异倍数PT检验值 数据集高表达间质浸润性乳腺癌3.5729.37×10-2315.786Finak Breast低表达浸润性导管乳腺癌-2.6665.03×10-13-10.667Zhao Breast低表达小叶乳腺癌-2.1612.50×10-7-7.272Zhao Breast低表达浸润性导管乳腺癌-2.9801.27×10-111-40.280Curtis Breast低表达浸润性小叶乳腺癌-2.4808.68×10-5319.841Curtis Breast低表达浸润性小叶乳腺癌和导管乳腺癌-2.7095.60×10-36-17.550Curtis Breast低表达乳腺癌-3.3227.49×10-9-11.318Curtis Breast低表达小叶乳腺癌-2.5375.56×10-30-16.528Curtis Breast低表达黏液性乳腺癌-2.9485.10×10-21-14.645Curtis Breast低表达髓质乳腺癌-3.2552.10×10-14-12.151Curtis Breast低表达浸润性乳腺癌-2.9292.51×10-8-8.188Curtis Breast低表达原位导管乳腺癌-2.1492.00×10-4-5.322Curtis Breast低表达导管乳腺癌-3.4931.59×10-11-9.175Richardson Breast 2低表达间质浸润性导管乳腺癌-2.0865.25×10-5-4.931Ma Breast 4低表达浸润性导管乳腺癌-3.0142.38×10-44-19.088TCGA Breast低表达浸润性乳腺癌-2.2856.02×10-20-10.732TCGA Breast低表达浸润性小叶乳腺癌-2.0736.71×10-9-6.798TCGA Breast低表达间质浸润性导管乳腺癌-2.4942.18×10-4-4.941Karnoub Breast低表达浸润性乳腺癌-2.9687.67×10-4-8.135Gluck Breast

括号内数值为相应组患者数图2 SASH1 mRNA的表达水平与乳腺癌临床病理参数的关系Figure 2 The relationship between mRNA expression of SASH1 and clinicopathological parameters of breast carcinoma

2.3 SASH1在乳腺癌患者中低表达及与临床病理学参数的关系

为了验证SASH1在乳腺癌中的表达水平及与临床病理参数的关系,课题组选取了80例乳腺癌患者标本和29例癌旁正常组织,进行免疫组织化学法分析，结果证实,29例癌旁正常组织中SASH1明显高表达(22/29,75.9%),而在80例乳腺癌组织中SASH1明显低表达(67/80,83.8%),SASH1表达差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。这一发现也与“结果2.1”中Oncomine数据库所发现的SASH1 mRNA在大多数乳腺癌患者中低表达的结果一致。

A.正常组织中SASH1表达水平;B-E.分别为乳腺癌组织中SASH1表达阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性图3 免疫组织化学法分析SASH1在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况 (DAB,×200) Figure 3 Immunohistochemical analysis of SASH1 protein expression in breast cancer tissues andnormal breast tissues (DAB,×200)

同时,通过分析SASH1蛋白表达水平和乳腺癌患者临床病理学参数的关系来验证bc-GenExMiner v4.0在线数据库得出的SASH1 mRNA水平与临床病理学参数的关系是否可靠。结果证实80例进行淋巴结清扫的乳腺癌组织中,淋巴结转移阴性的SASH1低表达率略高于淋巴结转移阳性组,但无统计学差异(88.1%vs78.9%,P>0.05);同样以51岁为界将患者分成两组,结果发现≤51岁SASH1低表达的患者明显高于SASH1高表达患者(SASH1低表达和高表达分别为61例和2例)。然而大于51岁的患者中,SASH1高表达的患者数量明显高于低表达患者(SASH1高表达和低表达分别为11例和6例),并且这一表达的不一致性的差异有统计学意义(P<0.01);同时,根据肿瘤面积和肿瘤分级进行分组讨论时也发现SASH1低表达与其相关(P<0.05),并且肿瘤分级越低SASH1高表达率越高,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级的SASH1高表达率分别为32.0%，11.1%和5.3%(见表2)。这一发现也与“结果2.2”中bc-GenExMiner v4.0在线数据库所发现的乳腺癌患者SASH1 mRNA表达水平与临床病理学的关系相对应。

2.4 SASH1高表达提高乳腺癌患者的生存时间

Kaplan-Meier曲线分析发现,在SASH1 mRNA表达水平和乳腺癌预后的3个数据集中,SASH1高表达均能延长患者的RFS,提高患者的预后,且差异有统计学意义(P<0.05),226022-at数据集、213236-at数据集和41644-at数据集的HR分别为0.78,0.88和0.87;然而,SASH1高表达虽然可以延长患者的OS,但差异无统计学意义(P>0.05,见图4)。

表2乳腺癌组织中SASH1蛋白表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系

Table2AssociationofSASH1expressionwiththeclinicalparametersofbreastcancerpatients

临床病理参数nSASH1低高卡方检验值P淋巴结转移1.23>0.05 阳性38308 阴性42375肿瘤直径7.96<0.05 ≤1 cm18153 1.1-2 cm24168 2.1-3 cm24231 >3 cm1091组织学分级6.94<0.05 Ⅰ25178 Ⅱ36324 Ⅲ19181年龄37.24<0.01 ≤51岁63612 >51岁17611

2.5 SASH1突变不会影响乳腺癌患者的预后

在1 098例乳腺癌标本中,有67例发生了突变(6%)(见图5A)。通过Kaplan-Meier曲线分析发现,SASH1突变不会影响乳腺癌患者OS和DFS,说明SASH1突变与否都不会改变患者的预后(见图5)。

图4 Kaplan-Meier分析乳腺癌患者中SASH1mRNA表达水平的预后价值Figure 4 The prognostic value of SASH1 mRNA level in BC patients by Kaplan-Meier plotter

图5 SASH1基因突变对乳腺癌患者预后影响的cBioPortal分析Figure 5 Analysis of the influence of SASH1 gene mutation on the prognosis of patients with breast cancer by cBioPortal

3 讨论

在过去的几十年里,乳腺癌的治疗有了很大改善,但在澳大利亚、美国和英国等发达国家都仍有15%-20%的患者术后生存时间小于10年[6]。关于这方面的花费占据了公共卫生部门有关癌症相关的发病率和死亡率成本的很大一部分。对于当前一线治疗无效的肿瘤其治疗可能更复杂[10]。未来的疾病控制将取决于对疾病分子生物学的更多了解,从而确定与诊断相关的基因的新型个性化医疗方法[11]。

SASH1作为一种抑癌基因已有报道,其高表达可能促进癌细胞的凋亡[8]。但关于SASH1与乳腺癌患者预后方面的研究还非常少,通过检索Pubmed数据库仅发现14篇SASH1与乳腺癌关系的研究,这些文章绝大多数仅仅研究了SASH1与乳腺癌发生发展的关系,并没有去进一步探讨SASH1对乳腺癌患者预后的影响。

本研究通过生物信息学技术,利用Oncomine、Breast cancer gene-expression miner v4.0、Kaplan-Meier Plotter、TCGA data and cBioPortal等在线数据库,结合免疫组织化学实验综合分析了SASH1表达水平和乳腺癌患者的关系。

Yang等[12]证实,SASH1表达水平与胶质瘤WHO分级密切相关。在121个病例中,SASH1低表达占66.9%,且其中大多数为Ⅲ-Ⅳ级,而33.1%的SASH1高表达的病例中大多数为Ⅰ-Ⅱ级。这说明SASH1表达水平与胶质瘤分级密切相关,在较低恶性程度时表现出较高的表达,随着恶性程度的增加而显著下降。原发性肝癌和甲状腺肿瘤中,SASH1 mRNA表达水平明显降低[13]。与相应正常组织比较,50例乳腺癌组织标本中有37例(74%)的SASH1表达明显下调[14]。Gong等[8]研究也发现,与对照组相比,乳腺癌患者中SASH1的阳性率显著降低(63/186,33.9%)。这些研究都表明了SASH1在乳腺癌的发生发展过程中扮演了一个关键角色。我们通过Oncomine数据库进行基因差异性表达分析发现,与正常组织相比,乳腺癌组织中SASH1 mRNA的表达明显下降,18个数据集的SASH1 mRNA低表达,1个数据集的SASH1 mRNA高表达,差异有统计学意义(见图1，3和表1)。因此,这一研究结果表明乳腺癌组织中SASH1 mRNA表达下调。

李述等[5]证实SASH1低表达与乳腺癌的转移和分级呈正相关,而与淋巴结转移无关。同时,一些研究也揭示SASH1表达下降与肿瘤大小、侵袭性生长、转移和生存率低有关[13-15]。SASH1表达增强与U251胶质瘤细胞侵袭能力降低有关[12]。从组织学类型上看,SASH1表达阳性率在浸润性导管癌、浸润性小叶癌、黏液癌和浸润性筛状癌中无统计学差异[8]。Burgess等[7]最近报道了在雌激素受体阳性和阴性乳腺癌中SASH1表达的存在显著差异,但人类表皮生长因子受体2(HER2)阳性和阴性乳腺癌之间却没有发现SASH1阳性率存在统计学差异。以上研究都表明SASH1的表达水平可能与乳腺癌患者的临床病例参数有关。本研究通过bc-GenExMiner v4.0在线数据库和免疫组织化学实验分析发现,在Her2阳性的乳腺癌中SASH1 mRNA表达明显增加,而这一现象却没有在雌激素受体阳性或孕激素受体阳性的病人中观察到,在这类病人中,SASH1 mRNA水平不存在统计学差异。通过对SBR与SASH1 mRNA表达水平之间关系的分析,得出SASH1表达水平越高,SBR(乳腺癌组织学分级)等级越低,病人恶性程度越低。同时,统计学分析也发现,SASH1表达水平与患者年龄密切相关,在老年患者中,SASH1表达水平明显增加,这一发现也与临床上乳腺癌常发生于中青年患者的现象符合(见图2和表2)。

Zhou等[16]研究发现SASH1表达下调与胃癌预后差有关。但总的来说,关于SASH1表达与肿瘤患者预后关系的研究还很少。特别是SASH1表达与乳腺癌患者预后的研究就更少[17]。本研究通过Kaplan-Meier曲线发现,在3个数据集中SASH1高表达均能延长乳腺癌患者的RFS,提高患者的预后,且差异有统计学意义(P<0.05,226 022-at,213 236-at,41 644-at的HR分别为0.78,0.88,0.87),说明SASH1高表达是一个保护因素,可以促进癌细胞凋亡,抑制癌细胞侵袭和迁移。反之,肿瘤病人中SASH1表达下调会加速肿瘤转移,缩短病人生存时间,对病人预后不利。当我们通过cBioPortal数据库分析SASH1突变是否会影响乳腺癌预后时,结果发现SASH1突变与否,患者的OS和DFS的变化无统计学差异。这一发现与本研究前面的结论相悖,其原因是SASH1突变不仅有SASH1 mRNA表达上调和下调。在本研究中,我们发现有6%的乳腺癌病人SASH1发生了突变,其中包括错义突变、扩增、缺失、mRNA上调和蛋白上调,因此SASH1突变生存曲线包含的病人不仅是SASH1 mRNA表达上调的,还包括其他突变类型病人,如果要明确其他突变是否会影响病人的预后,尚需进一步的临床试验来证实。

在本研究中,我们系统地分析了SASH1在乳腺癌中的表达和预后价值,从而更好地理解了乳腺癌的分子生物学异质性和复杂性。我们的发现进一步证实SASH1作为一个抑癌基因在乳腺癌中低表达,SASH1低表达将导致患者预后不良。本研究也揭示了SASH1是乳腺癌治疗的一个潜在生物靶点,同时也是监测乳腺癌患者预后的一个潜在生物标志物,能为患者预后提供一个更准确的判断。