Hsp90抑制剂WK-88-1对人乳腺癌细胞迁移与侵袭的影响

吴成柱,赵玉茹,李红梅

(1蚌埠医学院药物化学教研室,蚌埠 233030;2安徽省生化药物工程技术研究中心;3蚌埠医学院中医药基础教研室;*通讯作者,E-mail:athongmei@foxmail.com)

乳腺癌的发病率位居女性恶性肿瘤的首位,并呈现逐年增高的趋势,严重危害着女性健康和生命[1-3]。研究表明,侵袭与转移是乳腺癌患者治疗失败和死亡的主要原因之一[4]。因此,寻找有效、安全的抑制乳腺癌细胞侵袭和转移的药物是治疗乳腺癌的重要策略。

热休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)作为分子伴侣蛋白,参与细胞内众多顾客蛋白的构象成熟和稳定,其顾客蛋白包括Akt、Raf、Her-2、HIF-1α及突变信号蛋白p53等[5,6]。Hsp90与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭与转移密切相关,已成为了抗肿瘤药物研发的重要靶点之一[7]。天然产物WK-88-1是一种从放线菌株(Streptomyces hygroscopicus AC2)培养液中分离得到的安莎霉素类化合物[8]。作为典型的Hsp90抑制剂,WK-88-1具有低肝毒性的同时,还具有较强的抗肿瘤活性,如抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移与侵袭,诱导乳腺癌细胞凋亡和细胞周期阻滞等作用[9-11]。然而,WK-88-1对乳腺癌细胞的迁移与侵袭的相关研究未见报道。因此,本研究以人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7为细胞模型,首次探讨WK-88-1对乳腺癌细胞的迁移与侵袭的影响,并对其可能机制进行初步研究,为治疗乳腺癌侵袭与转移提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞购于中科院上海细胞库。胎牛血清(四季青公司,中国),DMEM培养基、胰蛋白酶(Gibco公司,美国),MTT试剂、氯化钴(CoCl2)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司,美国),Transwell小室(Corning公司,美国),Matrigel基质胶(BD公司,美国),兔抗人HIF-1α(Abcom公司,英国),兔抗人MMP-9、鼠抗人β-actin(Santa Cruz公司,美国)。WK-88-1是本课题组从放线菌株S.hygroscopicus AC2中分离纯化得到,经HPLC分析检测其纯度>95%[11]。

1.2 细胞培养及MTT法检测细胞存活率

人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞使用DMEM培养基(含有10%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/L链霉素,3.7 g/L碳酸氢钠),放置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞,经0.25%胰蛋白酶消化,按5 000个细胞/孔的密度接种于96孔板中,继续培养。待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的WK-88-1(1.562 5,3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L),继续培养12,24,36 h。培养结束后,每孔加入5 g/L的MTT溶液各10 μl孵育4 h,除去培养液,每孔加入150 μl的DMSO,用酶标仪在490 nm波长下检测各孔的吸光度值。计算细胞存活率,绘制剂量效应曲线,并计算IC50值。上述实验重复3次。

1.3 集落克隆实验

将MDA-MB-231和MCF-7细胞按1×105个/孔的密度接种于6孔板中培养,待细胞贴壁后,加入不同浓度的WK-88-1(0.1,0.3,0.5 μmol/L),继续培养7 d,每隔3 d更换培养液。培养结束后,用预冷的PBS洗涤2次,再经4%多聚甲醛固定15 min。除去固定液,加入结晶紫染色液染色15 min后,用双蒸水洗去染色液,并在室温下晾干,拍照。上述实验重复3次。

1.4 划痕实验检测细胞运动能力

将6×105个MDA-MB-231细胞接种于60 mm培养皿中培养,待细胞铺满并成单层贴壁后,用200 μl的枪头划痕,并用PBS洗去被划掉的细胞。加入不同浓度的WK-88-1(1.562 5,3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L),继续培养24 h拍照记录,并用Image J软件计算划痕处细胞间距。

1.5 Transwell迁移实验

将Transwell小室置于24孔板内,取对数生长期的MDA-MB-231和MCF-7(其中MCF-7细胞预先用150 μmol/L氯化钴处理12 h,诱导细胞缺氧状态,使MCF-7细胞运动能力加强),用无血清的DMEM培养液稀释细胞至8×104/ml,每个Transwell小室上室为200 μl细胞悬液,并加入不同浓度的WK-88-1,使WK-88-1的最终浓度为3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L。而Transwell下室各加入含10%胎牛血清的培养液800 μl,培养24 h取出小室,用棉签擦掉未迁移的细胞,再经4%多聚甲醛固定、结晶紫染色,并随机选取5个200倍视野显微镜下观察拍照。并计算细胞迁移抑制率[12],细胞迁移抑制率(%)=(1-药物处理组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100%。

1.6 Transwell侵袭实验

每个Transwell小室上室均匀铺50 μl的Matrigel基质胶,放入细胞培养箱中1-2 h,待其凝固。用无血清的DMEM培养液稀释细胞至8×104/ml,每个Transwell小室上室为200 μl细胞悬液,并加入不同浓度的WK-88-1,使最终浓度为3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L,作用时间为36 h,其余步骤同“1.5 Transwell迁移实验”。并计算细胞侵袭抑制率[12],细胞侵袭抑制率(%)=(1-药物处理组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100%。

1.7 免疫印迹法

将MDA-MB-231和MCF-7(150 μmol/L的氯化钴预处理12 h)细胞按1.5×106个密度接种于60 mm培养皿中,继续培养。待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的WK-88-1(12.5,25,50 μmol/L),在37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中继续培养48 h。培养结束后,经蛋白提取、BCA法蛋白定量,SDS-PAGE后转移至PVDF膜上,并用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。用1×TBST缓冲液清洗3次,每次5 min,加入一抗(HIF-1α、MMP-9、β-actin)放置于4 ℃冰箱过夜孵育后,1×TBST缓冲液清洗3次,每次5 min,再室温孵育二抗2 h,并显色分析。

1.8 统计学方法

实验数据以均数±标准差表示,采用SPSS17.0软件对数据进行分析,组间比较使用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 WK-88-1对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖的抑制作用

量-效曲线结果显示,随着WK-88-1给药浓度的增加和作用时间的延长,MDA-MB-231和MCF-7细胞存活率逐渐降低,其作用36 h的IC50值分别为48.6 μmol/L和12.8 μmol/L(见图1),与文献[11]报道吻合。根据MTT实验结果,我们选取了低浓度的WK-88-1(0.1,0.3,0.5 μmol/L)处理MDA-MB-231和MCF-7细胞7 d后,观察到WK-88-1能显著抑制细胞集落的形成,对MDA-MB-231细胞集落形成抑制率分别为(6.82± 8.27)%,(66.53± 6.42)%,(75.84± 1.41)%,对MCF-7细胞集落形成抑制率分别为(4.02± 3.01)%,(44.27± 12.51)%,(77.92±6.05)%,与对照组相比,差异具有显著性(P<0.05,见图2)。以上结果表明,WK-88-1对人乳腺癌细胞具有较强的抑制增殖作用,且呈现浓度和时间依赖性。

A.WK-88-1对MDA-MB-231细胞存活率的影响B.WK-88-1对MCF-7细胞存活率的影响与对照组(0 μmol/L)相比,*P<0.05,**P<0.01图1 WK-88-1对人乳腺癌细胞存活率的影响Figure 1 The survival rate of human breast cancer cells after treated with WK-88-1

与对照组(0 μmol/L)相比,*P<0.05,**P<0.01图2 WK-88-1对人乳腺癌细胞集落形成能力的影响Figure 2 The colony forming ability of human breast cancer cells after treated with WK-88-1

2.2 WK-88-1对人乳腺癌细胞运动能力的影响

划痕实验结果显示,WK-88-1显著抑制MDA-MB-231细胞运动能力(见图3)。与对照组比较,给药组(6.25,12.5,25,50 μmol/L)的细胞运动抑制率分别为(69.00± 0.47)%,(83.89± 0.62)%,(83.69± 0.32)%,(89.78± 0.68)%(P<0.01)。

图3 不同浓度WK-88-1对人乳腺癌MDA-MB-231细胞运动能力的影响Figure 3 The migration ability of human breast cancer MDA-MB-231 cells after treated with WK-88-1

2.3 WK-88-1对人乳腺癌细胞的迁移能力的影响

本研究采用Transwell小室法检测了WK-88-1对乳腺癌细胞迁移能力的影响(见图4)。随着WK-88-1给药浓度(3.125,6.25,12.5,25,50 μmol/L)的增加,乳腺癌细胞迁移能力显著减弱,呈现浓度依赖性(见图5)。与对照组相比较,50 μmol/L的WK-88-1处理MDA-MB-231和MCF-7细胞时迁移抑制率分别为(67.25± 3.12)%和(78.15± 2.57)%。

2.4 WK-88-1抑制乳腺癌细胞的侵袭能力

Transwell小室法结果显示,不同浓度的WK-88-1处理MDA-MB-231和MCF-7细胞36 h后,乳腺癌细胞的侵袭能力显著减弱,并呈现浓度依赖关系(见图6)。与对照组相比较,50 μmol/L的WK-88-1处理MDA-MB-231和MCF-7细胞时侵袭抑制率分别为(64.22± 2.84)%和(70.56± 2.80)%(见图7)。

图6 WK-88-1对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞侵袭的影响 (×200)Figure 6 Effect of WK-88-1 on invasion of human breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cells by Transwell assay (×200)

A.WK-88-1抑制MDA-MB-231细胞侵袭B.WK-88-1抑制MCF-7细胞侵袭与对照组(0 μmol/L)相比,*P<0.05图7 WK-88-1抑制人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞侵袭Figure 7 WK-88-1 inhibits MDA-MB-23 and MCF-7 cells invasion

2.5 WK-88-1对乳腺癌细胞HIF-1α和MMP-9蛋白表达的影响

本研究用不同浓度的WK-88-1分别处理MDA-MB-231和MCF-7细胞48 h,通过免疫印迹法观察了Hsp90顾客蛋白HIF-1α和MMP-9的表达情况。随着WK-88-1给药浓度的增加,与侵袭和转移相关蛋白HIF-1α和MMP-9的表达依次下调,且呈现一定的浓度依赖关系(见图8)。

3 讨论

天然产物具有结构多样性和生物多样性,一直是发现先导化合物和新药的重要来源之一。WK-88-1是从放线菌株(Streptomyces hygroscopicus AC2)培养液中分离得到的安莎霉素类化合物,是典型的Hsp90抑制剂[8]。Hsp90在肿瘤细胞中高表达,其抑制剂对肿瘤细胞具有选择性杀死作用,同时多个Hsp90抑制剂作为治疗乳腺癌新药处于临床试验阶段[13]。以往研究表明,WK-88-1具有较强的体内外抗肺癌作用及低肝毒性[9,10]。Zhao等[11]报道,WK-88-1可诱导乳腺癌细胞发生caspase依赖和线粒体依赖的凋亡及G2/M细胞周期阻滞。然而,WK-88-1是否具有抑制乳腺癌细胞迁移与侵袭的研究尚无报道。本研究首次证实了WK-88-1明显抑制乳腺癌细胞的迁移与侵袭的作用,为寻找抗乳腺癌侵袭与转移的药物具有重要意义。

乳腺癌细胞作为女性常见的全身性恶性肿瘤,侵袭与转移是多数乳腺癌患者死亡的重要原因[4]。特别是三阴性乳腺癌患者(triple-negative breast cancer,TNBC)占乳腺癌患者的15%左右,具有易转移、易复发等特征,并对靶向药物赫赛汀及内分泌治疗均不敏感[14]。肿瘤细胞在缺氧条件下,通过HIF-1α介导的信号通路和下游基因的激活,调控肿瘤细胞的侵袭转移、血管生成、多药耐药及能量代谢[15]。HIF-1α是肿瘤细胞在缺氧环境下的关键调控蛋白,可作为克服肿瘤细胞侵袭与转移的潜在靶点[16]。研究表明,CoCl2作为铁螯合酶的底物,代替Fe2+离子与血红蛋白结合,使细胞处于缺氧状态[17]。本研究以高侵袭与转移的TNBC系MDA-MB-231细胞和CoCl2诱导的MCF-7细胞为细胞模型(均高表达HIF-1α),模拟乳腺癌细胞的侵袭、迁移过程,具有一定的可靠性。划痕实验和Transwell结果表明,WK-88-1能有效、浓度依赖性地抑制人乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力。

肿瘤细胞的侵袭与转移是多种因素调控的、多步骤的复杂过程,其中细胞外基质(ECM)和基底膜的破坏是关键的步骤。基质金属蛋白酶(MMPs)与肿瘤的侵袭与转移关系密切,如MMP-2、MMP-9等能降解和破坏ECM和基底膜,使肿瘤细胞进入循环系统,导致肿瘤细胞的侵袭与转移[18,19]。同时,有趣的是HIF-1α和MMP-9均是Hsp90的顾客蛋白。本研究通过免疫印迹法观察到了WK-88-1处理乳腺癌细胞,能够浓度依赖性地下调HIF-1α和MMP-9蛋白,其可能机制是WK-88-1抑制了Hsp90分子伴侣功能,下调细胞内的HIF-1α和MMP-9蛋白表达,从而抑制乳腺癌细胞的迁移与侵袭。

综上所述,本研究首次证实WK-88-1是抑制人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞迁移与侵袭的有效化合物,具有一定的应用潜力。遗憾的是本研究仅在体外细胞模型中探讨了WK-88-1抑制迁移与侵袭的作用,需进行进一步的体内药效学的研究,为持续研究提供科学依据。