长链非编码RNA LINC01503在哮喘患儿中的表达及作用的病例对照研究

夏 莉 刘丽娟 王 香 孙立成 付劲蓉 韩 晓 钱莉玲 周玉峰,2

支气管哮喘(简称哮喘)是儿童呼吸道最常见的慢性疾病之一，主要表现为气道慢性炎症与气道高反应性[1]。哮喘是由遗传、环境和表观遗传学因素共同作用而导致的一种炎症性疾病[2, 3]。流行病学研究显示，近年来哮喘的发病率呈快速上升的趋势[4]，DNA序列不可能在短期内发生剧烈变异，因而表观遗传学因素的改变可能在其中发挥更大作用。表观遗传学调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等[5]。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类本身不编码蛋白、转录本长度>200个核苷酸的RNA分子，可在多层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达，已经成为免疫学关注的热点[6]。巨噬细胞是呼吸道最主要的炎症细胞，在哮喘的发病中起着重要作用[7]。巨噬细胞根据激活途径的不同，可分为经典激活M1型和替代激活M2型，巨噬细胞的活化状态可直接影响炎症性疾病的发生、发展和转归[8]，目前有关LncRNA对巨噬细胞极化的调控及在哮喘发病中的作用还少有报道。有报道LncRNA LINC01503能促进细胞外调节蛋白激酶(ERK)的活化，因此推测LncRNA LINC01503对巨噬细胞极化具有调控作用，本研究期望为非编码RNA调控的巨噬细胞极化在哮喘疾病中的作用提供实验证据。

1 方法

1.1 研究设计 病例对照研究。哮喘组为门诊诊断哮喘的患儿，健康对照组为健康体检儿童，检测两组外周血单个核细胞(PBMC)中LncRNA LINC01503的表达情况。通过siRNA敲低THP1细胞系中LncRNA LINC01503的表达，探索LncRNA LINC01503对巨噬细胞M1和M2型极化的调控作用。

1.2 伦理 本研究实验方案得到了复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会的批准。

1.3 哮喘组纳入和排除标准 纳入同时满足以下各项的连续患儿：①2017年8月26日至2018年1月11日我院呼吸科门诊喘息反复发作且未正规治疗的患儿，②由同1名主治医生接诊并参照2016版《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[9]诊断为哮喘，③获得患儿家长口头知情同意采血用于本研究检测。排除合并其他呼吸道疾病(如肺炎)、心血管系统疾病、神经系统疾病的患儿。

1.4 健康对照组纳入和排除标准 纳入在我院健康体检门诊行体检的儿童，根据哮喘组入组患儿的性别和年龄按1∶2进行匹配。获得对照组儿童家长的口头知情同意，采血用于本研究检测。排除有过敏史及近期呼吸道感染者。

1.5 PBMC分离 采用Ficoll-Hypaque(GE Healthcare)梯度离心法。将血液用PBS等体积稀释，缓慢加入等体积的Ficoll-Hypaque中，400 g 缓升缓降离心30 min，吸取第二层单个核细胞悬浮液，加入新的离心管，离心，PBS洗2次，所获得细胞即为PBMC。

1.6 细胞培养 THP1细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。细胞培养条件：在含有10%胎牛血清(Gibico)、100 U·mL-1青霉素、50 μg · mL-1链霉素的1 640(Gibico)培养基中，37℃、5% CO2浓度的条件下培养。巨噬细胞分化：500 ng·mL-1佛波酯(PMA，Sigma)刺激THP1细胞48 h，换液，弃掉悬浮细胞，贴壁细胞即为分化的巨噬细胞。

1.7 siRNA 转染 siRNA序列见表1，由上海吉玛生物公司设计。siRNA转染浓度为200 nmol·L-1，使用LipoRNAiMax(invotrogen)进行转染。 细胞于转染后第2 d进行换液，转染48 h后加LPS或IL-4刺激巨噬细胞。

1.8 RT-qPCR 在炎症状态下，外周血单核细胞会进入肺部转化为巨噬细胞[10]。巨噬细胞是呼吸道数量最多的免疫细胞，在不同环境因素的刺激下会向不同的方向活化，伴随一系列基因的表达发生动态变化，从而对疾病发挥不同的调控作用[8]。为探究LINC01503在巨噬细胞不同活化过程中其表达是否发生改变，分别采用LPS 200 ng·mL-1和IL-4 20 ng·mL-1诱导巨噬细胞向M1和M2方向活化，RT-qPCR检测LINC01503的表达情况。采用Trizol(Ambion)提取总RNA，用Takara RR037A 反转录试剂盒将Total RNA反转录成cDNA。用上海翊圣生物科技公司HieffTMqPCR SYBR®Green Master Mix(No Rox)进行qPCR荧光定量检测。Primer premier 5 用于引物设计，序列见表1，引物由上海生工公司合成。采用GAPDH作为内参，数据分析采用2-△△CT法。

表1 siRNA序列及RT-qPCR引物序列

1.9 Western blot 分离胶和浓缩胶配胶试剂购于上海碧云天生物公司及上海生工公司。Western blot 所使用抗体: P65、p-P65(ser536)、P38、p-P38: (Thr180/Tyr182)、JNK、p-JNK(Thr183/Tyr185)、ERK1/2、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、STAT6和p- STAT6 (Tyr641)均购于美国Cell Signaling Technology 公司。电泳、转膜、显影等相关仪器购于美国Bio-rad 公司。Western blot具体实验步骤参照抗体官网使用说明书。

2 结果

2.1 一般情况 符合本文哮喘组和健康对照组纳入和排除标准的样本分别为28例和46例，28例哮喘患儿均为轻症哮喘。哮喘组男∶女为19∶9，中位年龄5.0(2～11)岁；外周血平均嗜酸性粒细胞数每微升(425.8±248.7)个(正常值 60～300)，总IgE阳性率50.0%，气道阻力升高占74%。健康对照组男∶女为29∶17，中位年龄7.5(4～13)岁，均未行外周血嗜酸性粒细胞、IgE及气道阻力检测。

2.2 哮喘组和健康对照组PBMC中LINC01503的表达 图1A 显示，与健康对照组相比，LINC01503在哮喘组中的表达显著增高[(1.63±0.10)vs(1.01±0.04)，t=6.163，P<0.000 1]。图1B显示， 在哮喘组中，LINC01503的表达量与嗜酸性粒细胞的数量不相关(P=0.40)。

2.3 LINC01503 在巨噬细胞不同极化过程中的表达 LPS刺激巨噬细胞后，LINC01503表达下调(图2A)。IL-4刺激巨噬细胞后，LINC01503表达上调(图2B)。

2.4 LINC01503对巨噬细胞极化的影响 本文设计的siRNA能有效降低LINC01503的表达，敲低效率80%以上(图3A)。在敲低LINC01503后，M2型巨噬细胞活化标志基因CD206和CD209表达明显上调(图3B、C)，M1巨噬细胞活化的标志基因IL-6 、TNF-α和CXCL10的表达显著降低(图3D、E、F)。

2.5 LINC01503对巨噬细胞极化信号通路的影响 ①敲低LINC01503，LPS刺激巨噬细胞向M1方向极化，Western blot检测了对NF-κB及MAPK信号通路的影响，P65、P38和JNK的磷酸化水平未受明显影响，ERK的磷酸化水平明显降低(图4A)。②Western blot显示，敲低LINC01503后对IL-4信号通路中信号转导子与转录激活子6(STAT6)磷酸化的影响不明显(图4B)。

图1LINC01503在哮喘患者中的表达显著升高

注 A:采用RT-qPCR法检测LINC01503在哮喘组和健康对照组PBMC中的表达；B：LINC01503变化倍数与嗜酸性粒细胞计数的相关性分析。****，P<0.000 1

图2LINC01503在巨噬细胞极化中动态表达

注 A：LPS刺激巨噬细胞向M1方向极化，B：IL-4刺激巨噬细胞向M2方向极化，采用RT-qPCR法检测LINC01503在巨噬细胞极化中的动态表达

图3LINC01503对巨噬细胞极化的调节

注 A:siRNA敲低LINC01503的表达；IL-4刺激已经敲低LINC01503表达的巨噬细胞24 h, RT-qPCR检测CD206(B)和CD209(C)的表达；LPS刺激已经敲低LINC01503表达的巨噬细胞1.5 h, RT-qPCR检测IL-6(D)、TNF-α(E)和CXCL10(F)的表达。*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1

图4LINC01503促进ERK磷酸化

注 A：敲低LINC01503，LPS刺激15 min，Western blot检测了对NF-κB及MAPK信号通路的改变情况；B：敲低LINC01503后IL-4刺激15 min，检测对信号通路中STAT6磷酸化的影响

3 讨论

哮喘如今被视为一组异质性疾病，不同的哮喘表型具有不同的发病机制[11]，但炎症是哮喘发病的核心环节[1, 12]。既往对哮喘发病机制的研究主要集中于Th1/Th2细胞失衡、肥大细胞及嗜酸性粒细胞等释放的炎症因子对哮喘的影响 ，而巨噬细胞在哮喘发病中的作用并未引起足够重视[7, 13]。

巨噬细胞作为联系固有免疫和适应性免疫的桥梁，在许多慢性炎症性疾病和免疫性疾病如肥胖、动脉粥样硬化、糖尿病、肝脏纤维化、溃疡性结肠炎以及肿瘤的发生发展中均发挥着重要的调控作用[14]。巨噬细胞作为呼吸道最丰富的免疫细胞，对气道的炎症及免疫反应发挥着重要的调控作用[13]。巨噬细胞的不同活化类型与哮喘的严重程度及疾病的异质性有很大关系[15, 16]。在以Th2免疫反应为主的哮喘患者中，呼吸道巨噬细胞在高Th2炎症因子的刺激下向M2方向活化，活化的M2巨噬细胞可以高表达一系列细胞因子及趋化因子，继而促进Th2免疫反应而加重哮喘；在非Th2免疫反应的环境中，巨噬细胞被诱导向M1方向活化，活化的M1巨噬细胞可高表达IL-6、TNF-α及活性氮、氧分子，促进机体的Th1、Th17免疫反应，降低机体对激素治疗的敏感性，从而导致难治性哮喘的发生[3, 17]。巨噬细胞活化与刺激因素之间往往形成正反馈调控，因而无论在Th2型或非Th2型过敏性哮喘中，巨噬细胞活化不平衡的结果均能加重哮喘。因此，探索能够调控巨噬细胞活化的分子或许能为不同类型哮喘的发病及治疗提供新的思路[18]。

M1型巨噬细胞主要由LPS和IFN-γ等激活，MAPK和NF-κB等信号通路在其中发挥关键作用；M2型巨噬细胞主要由IL-4和IL-13等激活，主要涉及JAK-STAT-6信号通路[19, 20]。有研究发现长链非编码RNA LINC01503可与ERK2结合，抑制双特异性蛋白磷酸酶6(DUSP-6)对ERK2的去磷酸化作用，导致ERK磷酸化增加，而促进肿瘤的发生与发展[21]。但LINC01503对巨噬细胞的活化及哮喘中的作用尚未见报道。因为LINC01503参与MAPK信号通路的调控，推测LINC01503可能会参与巨噬细胞极化的调控。本研究显示，与健康对照儿童相比，LINC01503 高表达于哮喘组患儿；在M2活化的巨噬细胞中，LINC01503表达增高，而在M1活化的巨噬细胞中LINC01503表达下降。敲低LINC01503能上调巨噬细胞M2标志基因CD206和CD209表达, 下调M1标志基因如IL-6、TNF-α和CXCL10的表达。说明LINC01503能促进巨噬细胞向M1活化，抑制其向M2活化。在蛋白水平，本研究发现，LINC01503能促进ERK的磷酸化，但对M1活化有关的NF-κB、p38、JNK及M2信号转导分子STAT6等无显著影响，说明在巨噬细胞中，LINC01503主要通过促进ERK磷酸化促进M1的活化而抑制M2的活化。

儿童哮喘与成人有所不同，主要以Th2型过敏性哮喘为主。LINC01503可被Ⅱ型免疫反应因子如IL-4诱导表达，高表达的LINC01503能抑制巨噬细胞M2型活化，促进M1型活化，从而维持巨噬细胞活化的平衡。因此LINC01503可通过促进巨噬细胞活化的平衡，从而在一定程度上缓解哮喘的病情，这一结果与本文哮喘组患儿主要为轻度哮喘患者事实相一致。综上，LINC01503可通过负反馈调控巨噬细胞活化而促进巨噬细胞不同活化类型之间的平衡进而缓解疾病的进展。LINC01503有望成为判断病情的初步指标及治疗哮喘的潜在分子靶点。