儿童医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的临床特征和分离株分子特征

宁 雪 乔艳红 姚开虎 沈叙庄 刘 钢

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起医院相关性(HA)感染和社区相关性(CA)感染的重要病原，可以导致多种类型的感染。根据2017年中国细菌耐药监测网的报告，MRSA分离率占全部金黄色葡萄球菌的35%以上[1]。目前针对金黄色葡萄球菌流行克隆的报道，主要基于MLST分型。HA-MRSA流行克隆：北美是ST5克隆，南美是ST239克隆，欧洲是ST36、ST45和ST22克隆，南亚和澳大利亚是ST22克隆，中东和东亚洲地区是ST239克隆[2]；在中国大陆地区成人主要是ST239和ST5克隆[3]。既往本课题组针对儿童CA-MRSA感染进行了研究，但是国内对儿童HA-MRSA感染的报告相对较少。

1 方法

1.1 菌株来源 2010至2016年从首都医科大学附属北京儿童医院(我院)住院患儿的临床送检标本中分离得到的MRSA连续菌株。通过菌落的形态学对金黄色葡萄球菌进行初步鉴定，用凝固酶实验和头孢西丁纸片(30 μg，Oxoid)法对菌株进行筛查,冷冻状态下转运，以纸片法-20℃储存。

1.2 菌株纳入标准 从我院病历系统获得临床资料，纳入符合HA感染定义的病例且MRSA培养阳性，留取MRSA分离株；HA感染定义根据美国CDC诊断标准，指入院时不存在，也不处于感染潜伏期，入院≥48 h后发生的感染。

1.3 DNA提取 按照硅胶模型TM基因组DNA提取试剂盒(北京赛百胜基因技术有限公司)说明进行操作。以提取DNA作为模板，使用PCR方法检测菌株的mecA和nuc基因，阳性确定为MRSA。

1.4 分子分型

1.4.1 多序列分型(MLST，ST型) PCR检测7个管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil，参考Enright等[4]的引物设计。扩增片段长度约450 bp。扩增产物由北京天一辉远生物技术有限责任公司进行测序，测序结果在MLST数据网站(http://saureus.mlst.net)上对比等位基因序列型(sequence type, ST),从而判断菌株的ST型，使用eBURSTv3软件进行菌株亲缘关系(clonal complex，CC)分析。

1.4.2 SCCmec分型和亚型 采用文献[5]中的多重PCR方法进行SCCmec分型及亚型的检测。扩增产物在含1.5%溴乙锭琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪观察和保存结果。

1.4.3 spa分型 spa分型的PCR引物参考文献[6]设计。扩增产物由北京天一辉远生物技术有限责任公司进行测序，测序结果通过spa数据库 (http://www.ridom.de/spaserver)进行比对分型。

1.4.4pvl基因检测 参照Lina等[7]的引物设计，扩增片段长度433 bp。PCR产物在含溴乙锭的1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪观察实验结果。

1.5 体外药敏试验 根据美国国家临床实验室标准委员会(CLSI)制定的标准，采用琼脂稀释法检测所有菌株对16种药物的敏感性，替加环素、夫西地酸的敏感性依照欧洲抗菌药物敏感性实验执行标准(EUCAST)界定。金黄色葡萄球菌ATCC29213为质控菌株。MRSA多重耐药是指对3种及以上非β内酰胺类抗生素耐药。

1.6 统计学方法 实验数据采用SPSS 23.0 统计软件进行分析。计量资料以中位数表示，中位数比较采用秩和检验。计数资料以率表示，率的比较采用行×列表分析(卡方检验或Fisher’s确切概率检验)。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 符合本文菌株纳入标准的病例150例，菌株标本来源为呼吸道、脓液、血液、伤口、穿刺液和分泌物。男97例，女53例。年龄5 d至14岁，中位年龄为18个月，104例(69.3%)年龄<1岁，43例(28.7%)为新生儿。139例(92.7%)以发热为首发症状。死亡4例(2.7%)。

2.2 感染类型 单部位感染124例(82.7%) ，同时有2个及以上部位感染26例；肺炎83例 (55.3%), 皮肤及软组织感染(SSTIs) 69例 (46.0%), 血流感染21 例(14.0%), 骨髓炎5例(3.3%)，尿路感染1例 (0.7%)。

侵袭性感染52 例(34.7%)，包括肺炎15例, SSTIs 13例, 血流感染2例, 骨髓炎2例，尿路感染1例，肺炎+血流感染7例, SSTIs +血流感染6例, 骨髓炎+血流感染3例, 肺炎+ SSTIs +血流感染3例；非侵袭性感染包括肺炎51例, SSTIs 40例, 肺炎+SSTIs 7例。

2.3 基础疾病 42例(28%)有基础疾病，包括癌症32例, 免疫缺陷疾病5例, Ⅰ型糖尿病3例，先天性心脏病2例。

2.4 治疗情况 150例患儿在培养阳性结果出来之前都经验性使用抗生素。头孢类抗生素占90%(135例), 其中一至四代头孢菌素分别为4、32、72和27例，美罗培南32例，万古霉素6例。16例患儿外用了莫匹罗星软膏。117例(78%)在血培养阳性之后根据药敏结果更换了抗生素，其中83%(97例)更换为万古霉素，12%(14例)更换为利奈唑胺，5.1%(6例)更换为替考拉宁。

2.5 MRSA分离株的分子特征 表1显示，150株分离株共获得16种ST分型，分属于12个CC。ST分型中，ST239(46%，69株)为最常见克隆，其次是ST59(28%，42株)和ST5(4%，6株)。SCCmec分型中，Ⅲ型(52.7%，79株) 为最常见克隆, 其次是Ⅳ型 (30%，45株) 和 Ⅱ型 (8%，12株)；Ⅳ菌株共有3种亚型，Ⅳa 43株(95.6%), Ⅳb和Ⅳc 各1株。共获得32个spa型，t030 (33个, 22.0%)最常见，其次是 t437 (35个, 23.4%)和t037 (19个, 12.7%) 。

最常见的分子分型是ST239-SCCmecⅢ-t030 (34/65, 55.4%), 其次是ST59-SCCmecⅣa-t437 (27/42, 64.3%)。34株分离株 (22.7%)pvl阳性。MRSA ST239和ST59 的pvl携带率分别为14.5% (10/69) 和40.5% (17/42)。最常见的携带pvl的克隆型是ST59-SCCmecⅣa-t437 (13/34, 38.2%)。

2.6 抗生素敏感性 150株菌株对万古霉素、利奈唑胺和替吉环素敏感。对其他多种抗生素的耐药率情况见表2。ST239 与ST59对庆大霉素[84.1%(58/69)vs19.0%(8/42)] 、四环素[94.2%(65/69)vs45.2%(19/42)]、利福平[88.4%(61/69)vs9.5%(4/42)]和环丙沙星[94.2%(65/69)vs21.4%(9/42)]耐药率差异有统计学意义(P<0.01)。所有菌株、MRSA-ST59 和MRSA-ST239分离株的多重耐药率分别为84.0%、78.6% 和81.2%。不同的ST型分离株有不同的耐药谱，72.5% (50/69) 的MRSA-ST239分离株表现为两种形式的耐药，包括青霉素-头孢呋辛-庆大霉素-四环素-利福平-红霉素-克林霉素-环丙沙星 (36/69,52.2%)和青霉素-头孢呋辛-庆大霉素-四环素-利福平 (13/69,18.8%)，23.8%(10/42)的MRSA-ST59的耐药表型为青霉素-头孢呋辛-四环素-红霉素-克林霉素。

表1 HA-MRSA分离株的分子分型 (%)

注 NT：无法分型

表2 HA-MRSA分离株耐药情况(n)

注 PEN: 青霉素; CEF: 头孢呋辛; GEN: 庆大霉素; CHL: 氯霉素; TET: 四环素; RIF:利福平; ERY: 红霉素; CLI:克林霉素; AZI: 阿奇霉素; CIP: 环丙沙星; FUS: 夫西地酸; MUP: 莫匹罗星；VAN: 万古霉素；LIN： 利奈唑胺； TIG: 替吉环素； 1) MRSA-ST239与ST59 比较P<0.01

3 讨论

MRSA是一种传播范围广、致病力强的病原体，在世界范围内广泛流行，常与高致病率和病死率相关，根据中国细菌耐药监测网报道，MRSA感染占革兰阳性球菌感染的30%～50%[1]。本研究中，MRSA感染以婴幼儿为主，1岁以下婴儿占69.3%，国外一项研究也发现，<19岁人群中金黄色葡萄球菌的感染在0～4岁儿童中发生率最高[8]，这可能与该年龄段患儿的免疫系统发育不完善、抵抗力低有关。同时，院内MRSA感染疾病类型多达10种，提示院内MRSA感染临床表现多样。

MRSA院内感染流行克隆具有地域性分布，主要的流行克隆包括巴西克隆、匈牙利克隆、纽约/日本克隆、英国的EMRSA-16和EMRSA-15[9]。在亚洲地区，最常见的HA-MRSA是巴西型 (ST239-Ⅲ) 和纽约/日本型 (ST5-Ⅱ)[10]。中国成人常见院内感染克隆属于ST239和ST5[11，12]。在本研究中，儿童HA-MRSA最常见的克隆也是 ST239-Ⅲ, 与中国成人分布一致，但是本文ST59占28%， 而ST5-Ⅱ仅占5.3%。

近年来，也有报道称具有CA特征的MRSA在医院内出现，成为引起HA感染或导致院内爆发的克隆型[13]。USA 300是美国最常见的CA感染的流行克隆，近来数次在HA感染中被发现。在韩国，有24%的HA感染由常见的社区MRSA流行克隆ST72-Ⅳ引起[14]。在中国台湾地区，ST59-Ⅳ和ST59-Ⅴ被报道出现在HA感染中，并且引起约25%的血流感染[15]。在我国成人的研究中，社区常见克隆ST59尚没有大范围出现在HA感染中。本研究中，38.6%的病例是由ST59-Ⅳ/Ⅴ、ST88-Ⅳ、ST25-Ⅳ和ST72-Ⅳ等克隆型的MRSA引起，而这些克隆曾被报道分别是中国、南非洲地区、阿尔及利亚和韩国的主要社区流行克隆[16]。其中，ST59-Ⅳ/Ⅴ是我国儿童最常见的CA感染的流行克隆。CA-MRSA可以感染既往健康的人群，具有CA特征的MRSA逐渐在医院中出现，为HA感染的预防和控制带来了新的挑战，同时，暴露于院内的环境，抗生素的选择压力可能会导致CA来源菌株的耐药性增强，从而使得这些菌株同时具有强致病性和耐药性。

本研究中HA-MRSA分离株的pvl携带率为22.7%，高于来自澳大利亚成人(0.7%)和亚洲成人(13.2%)的报道[17,18]。CA特征的MRSA在院内蔓延，也增加了院内分离株的菌株毒力，具有CA分子特征的菌株可能在院内爆发流行或更广的传播。HA-MRSA公认的多重耐药菌之一，可能与其长期在院内流行承受的抗生素选择压力有关，在本研究中，菌株的多重耐药率达70%以上，且不同克隆型的抗生素耐药性也存在差异，其中ST239分离株对四环素、利福平、环丙沙星和庆大霉素的耐药率显著高于ST59分离株。MRSA高耐药性给临床用药选择带来了挑战，且目前已经出现对一线药物万古霉素耐药的MRSA，也提醒临床医师更加慎重和规范地选择抗菌药物，以提高治愈率、减少耐药菌的产生。

综上所述，医院相关性MRSA感染以低年龄组患儿常见，感染的疾病类型多、临床表现复杂。本研究中MRSA-ST239-Ⅲ-t030是最常见的流行克隆，其次是MRSA-ST59-Ⅳ-t427，菌株的超抗原基因携带率高，耐药率高，因此应该有更有效的措施控制MRSA感染的发生和抗生素的合理使用。