植物精油的抑菌性探究及其在化妆品中的应用

桂雨豪，孟 潇，陈庆生，龚盛昭,

（1.广州环亚化妆品科技有限公司，广东 广州 510663；2.广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300）

化妆品中的防腐体系是化妆品设计中重要的一环，防腐剂不但能抑制细菌、霉菌和酵母菌的新陈代谢，而且影响其生长和繁殖。化妆品中的防腐剂主要从以下几个方面发挥作用：破坏微生物细胞壁或抑制微生物细胞壁的形成；影响 细胞膜的功能；抑制蛋白质合成和致使蛋白质变性［1-3］。随着社会的发展以及消费者对于产品安全性要求的不断提高，传统防腐剂在化妆品中的安全性问题受到广泛关注， 消费者更加倾向于温和、无刺激、环保的化妆品。

植物精油是从植物的花、叶、茎、根或果实中，通过水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法 或溶剂提取法提炼萃取的挥发性芳香物质，主要由萜烯类、 醛类、醇类、酯类等化学分子构成［4］。研究报道［5］称，植物精油具有广谱的抗微生物活性，能够抑杀细菌、真菌和病毒。由于精油对微生物的作用可能有多个作用位点，因此精油的抗菌作用机制非常复杂［6］。基于此，本文选择6种化妆品常用精油，探究其在化妆品防腐体系中的作用，为精油的应用提供参考。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

白色假丝酵母菌（ATCC10231）、金黄色葡萄球 菌（ATCC6538）、大肠杆菌（ATCC8739）、铜绿假单胞菌（ATCC9027）、黑曲霉（ATCC16404），广东省微生物菌种保藏中心（广东省微生物研究所）；MH（Mueller Hinton）琼脂修饰培养基、PDA（Potato Dextrose Agar）修饰培养基，广东环凯微生物科技有限公司；肉桂精油、迷迭香精油、檀香精油、玫瑰精油、茶树精油、甜橙精油，德国DROM公司；甘油，德国EMERY公司；丁二醇，OXEA公司；EDTA-二钠，荷兰AKZONOBEL公司；卡波姆，美国LUBRIZOL公司；黄原胶，美国COKELCO公司；氢化聚癸烯，美国MOBIL公司；ARLACEL 165，德国BASF公司；聚二甲基硅氧烷，美国DOW CORING公司；ACNIBIO AP，瑞士CLARIANT公司；绵羊红细胞悬液，广州市药品检验所药理室；洁净工作台，苏州净化设备有限公司；生化培养箱，上海一恒科技仪器有限公司；霉菌培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；恒温恒湿箱，施都凯仪器设备上海有限公司。

其中，实验所用MH琼脂修饰培养基是在MH培养基中加入0.5%的Tween-20和1.5%的琼脂后高温灭菌配制；PDA修饰培养基是在PDA培养基中加入0.5%的Tween-20后经高温灭菌配制；ARLACEL 165由PEG-100硬脂酸酯、甘油硬脂酸酯组成；ACNIBIO AP由苯氧乙醇、羟苯甲酯、羟苯丁酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯异丁酯组成。

1.2 实验方法

1.2.1 6种精油的抑菌性试验

选择6种精油（玫瑰精油、迷迭香精油、檀香精油、肉桂精油、茶树精油、甜橙精油）进行抑菌试验，抑菌试验按照以下方法进行。

抗细菌活性研究：将MH修饰培养基琼脂熔化，分别将6种精油加入到MH琼脂培养基中，使培养基表面与培养皿最上层边缘高度差值为（3±0.2）mm（可使培养基上层蒸汽压控制在较高的范围内，最大程度减少精油的挥发，削弱该因素对实验产生的不可控影响），再用帕拉胶膜将平皿的边缘密封好。每种精油均配制成如下体积分数：0，0.016%，0.032%，0.064%，0.096%，0.128%，0.250%，0.50%和1%。在平皿上每孔分别添加0.2 mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的菌悬浮液，使受检样品最终含菌量的数量级达到105或106CFU/g，每组精油每个体积分数做3个平行，分别置于37 ℃恒温培养箱中培养，在接菌后的第1和7天取样分析样品中的菌落含量。

抗真菌活性研究：将PDA修饰培养基熔化，分别将6种精油加入PDA培养基中，使每种精油均配制成如下体积分数：0，0.016%，0.032%，0.064%，0.096%，0.128%，0.250%，0.50%和1%。在平皿上每孔分别添加0.2 mL黑曲霉、白色假丝酵母的菌悬浮液，使受检样品最终含菌量的数量级达到105或106CFU/g，并用帕拉胶膜将平皿的边缘密封好，每组精油每个体积分数做3个平行，置于28 ℃恒温培养箱中培养，在接菌后的第7和28天取样分析样品中的菌落含量。

1.2.2 基础膏霜的制备

将水相加热到80 ℃。将防腐剂加入油相中加热至80 ℃，搅拌至均匀。将油相倒入水相，9 000 r/min乳化3 min，冷 却至40 ℃后出料。膏霜具体配方如表1所示。

表 1 膏霜基质配方Tab.1 The cream formulation

1.2.3 不添加精油的膏霜防腐挑战测试

以上述膏霜为基质配方，按照0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%的防腐剂添加量进行制作，制作完成后，备用。

实验参考《中国药典》（2010年版，二部，附录XIX N）的微生物性能测试方法，分别用上述添加不同含量防腐剂的样品挑战一次加菌的28 d防腐性能测试。称取受试样20 g，分别添加0.2 mL混合细菌菌悬液和混合真菌菌悬液，使受检样品最终含菌量的数量级达到105或106CFU/g，搅拌均匀，每组做3个平行试验。在接菌后的第2，7，14和28天取样分析样品中的含菌量。

防腐测试判定标准为：在第7天时细菌菌落总数要求下降99.9%，在第7，14和28天持续下降；真菌总数在第7～28天不再出现。

1.2.4 添加精油的膏霜防腐挑战测试

根据1.2.1试验方法，选择具有较好抗菌活性的精油，添加在1.2.3中所述的6种不同防腐剂含量的膏霜配方中，搅拌均匀，备用。挑战一次加菌的28 d防腐性能测试，试验菌种、检测标准、样品检测周期、测试方法以及评判标准与1.2.3所述一致。

1.2.5 皮肤刺激性试验

将未添加精油的膏霜、添加精油的膏霜以及未添加任何防腐剂的空白膏霜进行皮肤刺激性对比试验。皮肤刺激性的测定是基于人体皮肤表面的脂类和蛋白与红细胞的细胞膜相似的原理，通过测定从红细胞中释放的血红蛋白量及其变性程度来评价细胞膜和蛋白的损伤，反映皮肤刺激性的大小［7-9］。

具体试验方法如下：在离心管中分别加入500 μL不同含量（用PBS进行稀释）的样品溶液和500 μL 2%（质量分数）的绵羊红细胞悬液，充分混匀。每个含量梯度均设置3个平行，以PBS为阴性对照（完全不溶血），以100 mg/L的SDS溶液为阳性对照（完全溶血）。置于37 ℃培养箱孵育3 h后，以2 000 r/min离心3 min，取上清液于酶标仪410，540和575 nm处测定吸光度值A样品组410/540/575，A阳性对照组410/540/575和A阴性对照组410/540/575。按如下公式分别计算样品的溶血率和蛋白变性指数（DI）。

根据溶血率作图确定回归方程，计算测试样品引起红细胞50%溶血时的样品质量浓度HC50（mg/L）以及样品体系分数为1%时的蛋白质变性指数DI。由HC50值和DI值计算样品的L/D值：L/D=HC50/DI。依据欧洲替代方法验证中心（ECVAM）的Red Blood Cell（RBC）实验测试方法及分级标准［10］，对测试样品刺激性程度进行分级，如表2所示。

表 2 化妆品产品刺激性分级标准Tab.2 The classification criteria of skin irritation for cosmetics

2 结果与讨论

2.1 6种精油抗菌试验结果

6种精油的抗细菌最低抑制体积分数如表3所示，抗真菌最低抑制体积分数如表4所示。

由表3可以看出，6种精 油中，对于细菌的抑制作用最好的是肉桂精油，甜橙精油、玫瑰精油、檀香精油的抑菌效果相当，迷迭香精油只有微弱的抑菌效果，而茶树精油在该试验体积分数下无抑菌作用，同时，精油对不同类型的细菌抑制效果存在差异，对革兰氏阳性菌的抑制效果要优于革兰氏阴性菌，可能是因为革兰氏阴性菌的细胞壁外有一层膜，限制了疏水性物质在细胞壁脂多糖中的 扩散。

表 3 6种精油抗细菌最低抑制体积分数Tab.3 The minimum inhibitory volume fraction against bacteria of six essential oils

表 4 6种精油抗真菌最低抑制体积分数Tab.4 The minimum inhibitory volume fraction against fungus of six essential oils

由表4可以看出，对于真菌的抑制作用最好的是肉桂精油，其次是甜橙精油和玫瑰精油，迷迭香精油和檀香精油体现出微弱的抑制真菌的作用，茶树精油在该体积分数下无抑菌效果。从对霉菌和酵母菌的不同抑制效果可以看出，精油对不同类型的真菌抑制效果存在差异，对酵母菌的抑制效果要优于霉菌。

不同类型的精油之间成分存在着较大的差异，肉桂精油中醛类占总含量的87%左右［11］，檀香精油的主要成分是檀香醇［12］，玫瑰精油中香茅醇的含量占90%左右［13］，甜橙精油主要成分是柠檬烯，达到了78%左右［14］，这些成分均能抑制细菌和真菌的生长，主要成分为醛类的精油抑菌效果较好。

2.2 不添加精油的膏霜防腐挑战结果

添加6个不同防腐剂含量梯度的膏霜防腐挑战结果如表5所示。

表 5 不添加精油膏霜防腐挑战测试结果Tab.5 The anticorrosion challenge test results of the cream without essential oil

由表5可以看出，未添加精油的膏霜在防腐剂含量为0.25%以上才能达到较好的防腐效果。

2.3 添加精油的膏霜防腐挑战结果

根据1.2.1的抑菌试验，选择抗菌效果较好的肉桂精油加入1.2.2所述的膏霜体系，考虑到实际生产成本，添加量定为0.01%，配方中其余含量均不变，防腐挑战结果如表6所示。

对比表5和6可以发现，当膏霜中不添加任何防腐剂时，只添加0.01%的肉桂精油不能达到安全的防腐效果。当膏霜中添加了0.01%肉桂精油后，防腐剂的含量在0.15%就可以达到良好的防腐效果，这说明在化妆品中添加精油能够大大降低防腐剂的使用量，精油对防腐剂有协同增效的作用。而防腐剂是化妆品中主要的过敏源和刺激源，因此，在化妆品中添加精油在降低防腐剂用量的同时也减轻了化妆品过敏、产生刺激的风险。

表 6 添加0.01%肉桂精油的膏霜防腐挑战测试结果Tab.6 The anticorrosion challenge test results of the cream with 0.01% cinnamon essential oil

2.4 皮肤刺激性试验结果

以样品质量浓度为横坐标，红细胞溶血率为纵坐标作图并确定回归方程。根据回归方程确定样品引起红细胞50%溶血时的质量浓度HC50，同时计算出1%样品体积分数下的蛋白质变性指数DI，得出L/D，根据表2，确定样品的刺激程度，试验结果如表7所示。

表 7 皮肤刺激性试验结果Tab.7 The results of skin irritation test

由L/D值可以看出，未添加任何防腐剂和精油的膏霜刺激性最低，添加了0.25%防腐剂而未添加精油的膏霜有轻微的刺激性，在膏霜中添加0.01%精油降低了膏霜中防腐剂的使用量，因此其L/D＞100，无刺激性，这说明在化妆品中精油的抑菌效果在降低防腐剂用量的同时，也降低了化妆品的刺激性。对比样品1和样品3，样品3的L/D值比样品1低，这说明精油对皮肤具有轻微的刺激性。

3 结论

通过研究6种精油的抗菌性，发现对细菌抑制作用最好的是肉桂精油，甜橙精油、玫瑰精油、檀香精油的抑菌效果相当，另外，精油对革兰氏阳性菌的抑制作用要优于革兰氏阴性菌。对真菌抑制作用最好的是肉桂精油，其次是甜橙精油和玫瑰精油，迷迭香精油和檀香精油体现出微弱的抑制真菌的作用，精油对不同类型的真菌的抑菌性也存在差异，对酵母菌的抑菌性要优于霉菌。精油的抗菌性与其化学成分有很大的关系，主要成分为醛、醇类的精油大多具有好的抑菌作用。

通过对比未添加精油的膏霜和添加0.01%肉桂精油膏霜的防腐挑战试验，发现在膏霜中添加0.01%的肉桂精油可以有效地降低膏霜中防腐剂使用量。通过皮肤刺激性试验，发现在均能通过防腐测试的前提下，添加了0.01%肉桂精油和0.15%防腐剂的膏霜L/D值为112.26，而只添加了0.25%防腐剂的膏霜L/D值为58.53，说明在化妆品中添加精油，在降低了防腐剂用量的同时，也降低了化妆品的刺激性。但是，当防腐剂用量均为0.15%时，添加了0.01%肉桂精油的膏霜L/D值比未添加的膏霜L/D值略低，这说明精油本身具有轻微的刺激性。