化妆品美白原料β-熊果苷 稳定性研究

闫秀芳，张 鑫，范倩文

（上海家化联合股份有限公司 科研部，上海 200080）

熊果苷即4-羟基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，又名熊果甙、熊果素等。目前已知的熊果苷有α-熊果苷、β-熊果苷和脱氧熊果苷。

熊果苷除具有抗炎、抑菌、镇咳、祛痰、平喘等多种药理作用外［1-3］，还是人黑色素细胞中酪氨酸酶的抑制剂，熊果苷能有效地抑制皮肤中的生物酪氨酸酶活性，阻断黑色素的形成，通过自身与酪氨酸酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，去除色斑和雀斑［4，5］。因熊果苷美白效果好［6］，且毒副作用极小［7］，被广泛地添加于美白类化妆品中。但由于熊果苷的天然提取物来源少、提取步骤繁多、产量低，故大部分市售熊果苷都是由氢醌转化而成。氢醌有很大的毒副作用，长期使用可引起皮肤外源性黄褐斑和白斑病，其进入血液后还会导致皮肤毒性、致癌性、遗传毒性［8，9］等。若熊果苷中含有残留的氢醌或者熊果苷分解成的氢醌都会给人体带来伤害，所以，添加了熊果苷的化妆品的安全性问题一直备受关注。调研发现市场上大部分熊果苷为β-熊果苷，α-熊果苷只有极少数厂家生产，而且售价是前者的8倍左右。为了模拟市售化妆品，本研究选用β-熊果苷研究其在化妆品中的稳定性。

本文以高效液相色谱法测定β-熊果苷分解产生的氢醌的含量为指标，来分析不同含量的β-熊果苷水溶液在不同pH、温度、放置时间以及表皮葡萄球菌（皮肤表面寄生菌群代表）、表皮细胞等因素对β-熊果苷稳定性的影响。同时研究β-熊果苷原料在不同温度、不同湿度下的稳定性，进一步研究维生素C、珍珠粉对β-熊果苷稳定性的影响。以期为今后添加β-熊果苷的水剂、粉剂类美白化妆品的配方设计、生产、包装设计以及存储和运输提供一定的理论指导作用。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱仪，配2487紫外检测器，美国Waters；XS205电子天平，梅特勒-托利多公司；培养箱，3M集团。

β-熊果苷，w≥99.0%，北京贝丽莱斯生物化学有限公司；氢醌标准品，w≥99.0%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；磷酸二氢钾（KH2PO4），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇，色谱纯，默克股份两合公司； 表皮葡萄球菌，ATCC12228，ATCC公司； 表皮细胞，ATCC公司。

10 mmol/L KH2PO4水溶液配制：取1.36 g KH2PO4于1 L容量瓶中，加水定容至刻度，待用。

1.2 色谱条件

ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温25 ℃；流动相A为乙腈，流动相B为10 mmol/L KH2PO4水溶液，采用等度洗脱程序（V（A）∶V（B）=5∶95），流动相使用前经0.45 μm有机滤膜过滤；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长290 nm。

1.3 不同含量β-熊果苷水溶液以及含β-熊果苷的粉剂类化妆品的稳定性考察

不同含量的β-熊果苷水溶液的制备：配制3%，5%和10%的β-熊果苷水溶液。分别将3种不同含量的β-熊果苷水溶液均分成3份，其中2份用磷酸调节pH=3和5，然后分别将β-熊果苷原液和pH=3和5的β-熊果苷水溶液分装成3小瓶，每瓶50 mL。贴好标签，分别存放于25，40和60 ℃的培养箱中。

β-熊果苷原料制备：取β-熊果苷原料，均分成12份，每份15 g，贴好标签，分别存放于 25 ℃，20%湿度；40 ℃，18%湿度；60 ℃，15%湿度以及40 ℃，75%湿度的培养箱中，每个条件下放3瓶做平行试验。

β-熊果苷+维生素C 粉类复配物样品制备：配制含2%维生素C+98% β-熊果苷的粉剂类复配物样品。均分成12份，每份15 g，贴好标签，分别存放于25 ℃，20%湿度；40 ℃，18%湿度；60 ℃，15%湿度以及40 ℃，75%湿度的培养箱中，每个条件下放3瓶做平行试验。

β-熊果苷+维生素C+珍珠粉粉类复配物样品制备：配制2%维生素C+10%珍珠粉+88% β-熊果苷的粉类复配物样品。均分成12份，每份15 g，贴好标签，分别存放于25 ℃，20%湿度；40 ℃，18%湿度；60 ℃，15%湿度以及40 ℃，75%湿度的培养箱中，每个条件下放3瓶做平行试验。

1.4 温度、含量对β-熊果苷水溶液稳定性的影响试验

将放置在25，40和60 ℃的培养箱中的含量为3%，5%和10%的β-熊果苷水溶液原液，在不同的时间点1，2，4，8和12周分别取样1 g至10 mL的比色管中，用 体积比为1∶1的甲醇-水溶液稀释定容。用高效液相色谱法测定是否有氢醌产生。

1.5 pH对β-熊果苷水溶液稳定性的影响试验

将放置在25，40和60 ℃的培养箱中，不同含量、pH=3和5的β-熊果苷水溶液在不同的时间点1，2，4，8和12周分别取样1 g至10 mL的比色管，用体积比为1∶1的甲醇-水溶液稀释定容。用高效液相色谱法测定是否有氢醌产生。

1.6 表皮葡萄球菌对β-熊果苷水溶液稳定性的影响试验

以本单位化妆品为例，β-熊果苷在化妆品中的添加量一般不会大于2%。考虑到实际化妆品中β-熊果苷的添加量，配制含有0，0.125%，0.5%和2% β-熊果苷的细菌培养液，均分成3份。其中1份加入表皮葡萄球菌，在37 ℃培养箱中培养24 h。另2份不加菌，分别在4和37 ℃培养箱中培养24 h。用高效液相色谱法测定是否有氢醌产生。

1.7 表皮细胞对β-熊果苷水溶液稳定性的影响试验

配制含有β-熊果苷0%，0.125%，0.5%和2%的细胞培养液，均分成2份。其中一份加入表皮细胞，另一份不加细胞。分别在37 ℃培养箱中培养24 h。用高效液相色谱法测定是否有氢醌产生。

1.8 温度和湿度对β-熊果苷原料稳定性的影响试验

将放置于25 ℃，20%湿度；40 ℃，18%湿度；60 ℃，15%湿度以及40 ℃，75%湿度的培养箱中的β-熊果苷原料分别在不同的时间点1，2，4，8和12周取样1 g至10 mL的比色管中，用体积比为1∶1的甲醇-水溶液稀释定容。用高效液相色谱法测定是否有氢醌产生。

1.9 维生素C和珍珠粉对β-熊果苷稳定性的影响试验

维生素C和珍珠粉是美白化妆品中常用的复配原料，研究含有维生素C、珍珠粉和β-熊果苷的美白粉剂复配物，发现三者复配后，β-熊果苷不稳定，有氢醌产生。为进一步研究维生素C和珍珠粉对β-熊果苷稳定性的影响，将含有2%维生素C的β-熊果苷以及含有2%维生素C和10%的珍珠粉的β-熊果苷放置于25 ℃，20%湿度；40 ℃，18%湿度；60 ℃，15%湿度以及40 ℃，75%湿度的培养箱中，分别在1，2，4，8和12周取样1 g至10 mL的比色管中，用体积比为1∶1的甲醇-水溶液稀释定容。用高效液相色谱法测定是否有氢醌产生。

2 结果与讨论

2.1 温度、含量对β-熊果苷水溶液稳定性的影响

不同温度对β-熊果苷水溶液稳定性的影响如表1所示。温度对含量为3%和5%的β-熊果苷水溶液的稳定性影响不大，在放置12周时，25 ℃放置温度条件下，开始检出氢醌。当β-熊果苷水溶液的含量进一步增大到10%时，放置在25与60 ℃下，4周时已开始检测到氢醌，且在60 ℃下，放置12周后，氢醌的含量达到3 615.3 μg/g。

2.2 pH对β-熊果苷水溶液稳定性的影响

不同pH对β-熊果苷水溶液稳定性的影响如表1所示。因人体皮肤的pH=5.5左右，护肤品的pH=4～7，所以未考察碱性条件对β-熊果苷稳定性的影响。由表1可以看出，相同含量、相同温度下，pH=5时β-熊果苷最稳定。pH=3时最不稳定。同时发现3个不同含量的β-熊果苷水溶液，在pH=5，温度为40 ℃时，放置12周均未产生氢醌。这对β-熊果苷在化妆品膏霜、乳液和化妆水中应用时温度的控制有一定的指导意义。

表 1 温度、含量和pH对β-熊果苷水溶液稳定性的影响Tab.1 Ef fect of temperature， content and pH on the stability ofβ-arbutin aqueous solutions

2.3 表皮葡萄球菌对β-熊果苷水溶液稳定性的影响

含β-熊果苷的化妆品涂抹在表皮上，经皮肤渗透，β-熊果苷与酪氨酸酶直接结合，加速黑色素的分解与排泄，从而减少皮肤色素沉积，祛除色斑和雀斑［4，5］。在人体表皮中有很多表皮细菌，若β-熊果苷在人体表皮层被细菌分解，就大大降低了β-熊果苷的美白效果。其中表皮葡萄球菌是皮肤表面常驻菌，且容易培养。如表2所示，以表皮葡萄球菌为例，其在含有不同含量β-熊果苷培养基中培养24 h后，均未检测到氢醌，说明表皮葡萄球菌不会导致β-熊果苷分解产生氢醌。

表 2 表皮葡萄球菌对β-熊果苷水溶液稳定性的影响Tab.2 Effect of Staphylococcus epidermidis on the stability of β-arbutin aqueous solutions

2.4 表皮细胞对β-熊果苷水溶液稳定性的影响

表皮细胞对β-熊果苷稳定性的影响见表3。由表3可知，在未添加细胞的培养液中，24 h后未检测到氢醌，在有表皮细胞的培养液中，随着培养液中熊果含量的增高，检测到的氢醌含量也在上升。同时观察到，表皮细胞未见死亡，说明在此β-熊果苷分解产生的低含量的氢醌条件下，未产生细胞毒性。表皮细胞对β-熊果苷的分解有促进作用，这也为护肤品中β-熊果苷的添加量提供了指导作用。

表 3 表皮细胞对β-熊果苷水溶液稳定性的影响Tab.3 Effect of epidermal cell on the stability of β-arbutin aqueous solutions

2.5 温度、湿度对β-熊果苷原料稳定性的影响

表4为温度、湿度对β-熊果苷原料稳定性的影响的实验结果。由表4可以看出，在不同的温度、湿度条件下放置12周后，均未分解产生氢醌。说明β-熊果苷原料在不同的温度、湿度条件下均很稳定。

表 4 温度、湿度对β-熊果苷原料稳定性的影响Tab.4 Effect of temperature and humidity on the stability of β-arbutin

2.6 维生素C和珍珠粉对β-熊果苷稳定性的影响

维生素C对β-熊果苷稳定性的影响如图1所示。由图1可知，在25 ℃，20%湿度；40 ℃，18%湿度；60 ℃，15%湿度的条件下放置12周，均未检出氢醌，在40 ℃，75%的条件下放置，随着放置时间的延长，释放的氢醌含量也在升高，12周后氢醌的含量达到344 μg/g。这一结果表明在潮湿的环境中维生素C会促进β-熊果苷分解产生氢醌，粉类化妆品β-熊果苷在与维生素C复配使用时，储存的环境要干燥。

图2为维生素C与珍珠粉对β-熊果苷稳定性的影响的实验结果。由图2可知，除放置在25 ℃，20%湿度条件下，储存1周，未检出氢醌外，其余条件下均有氢醌检出，且在40 ℃，75%的条件下释放产生的氢醌达822 μg/g。分析其原因可能是维生素C在吸湿吸潮的情况下会显酸性，β-熊果苷在酸性条件下是不稳定的。高含量的β-熊果苷粉类化妆品不宜与维生素C、珍珠粉复配使用。

2.7 讨论

本文模拟了β-熊果苷在化妆水中可能的添加量、可能的pH环境，化妆品稳定性考察的加速试验条件（40 ℃，3个月），设计了含量分别为3%，5%和10%，调节pH分别为3、5和原液，放置于25，40和60 ℃ 12周，考察其稳定性。试验结果表明β-熊果苷的水溶液在弱酸性（pH=5、原液）环境中，25和40 ℃条件下比较稳定；60 ℃条件下，放置4周后，随着时间的延长，会释放出氢醌。在酸性（pH=3）环境中，25 ℃条件下，4周内比较稳定，4周后，β-熊果苷会分解释放出氢醌。高温（40和60 ℃）条件下，1周内均有氢醌产生。秦良等［10］考察了0.9%的熊果苷水溶液在pH=1，5.2，8.0，13，室温下放置3 d的稳定性，结果表明pH=5.2和8.0的0.9%的熊果苷放置3 d是稳定的，在pH=1和13时不稳定。田宇等［11］的研究结果表明在化妆水、乳液、膏霜、面膜中添加5%的β-熊果苷，4～45 ℃条件下放置30 d，β-熊果苷在4种剂型中稳定性较好。本研究与秦良、田宇等的实验结果相比，同时考察了pH与温度、放置时间延长到12周，对β-熊果苷稳定性的影响。结果表明，温度、pH共同作用会影响β-熊果苷的稳定性，且随着放置时间的延长，分解产生的氢醌越多。

本文进一步研究了表皮葡萄球菌、表皮细胞分别与β-熊果苷共孵育24 h，发现表皮葡萄球菌不会导致β-熊果苷分解产生氢醌，表皮细胞会促进β-熊果苷的分解。房军等［12］研究了人手表皮微生物与β-熊果苷共孵育48 h，发现β-熊果苷分解产生氢醌。本研究相比于房军的实验，进一步研究了表皮细胞对β-熊果苷稳定性的影响，同时发现表皮微生物中的表皮葡萄球菌并没有导致β-熊果苷分解产生氢醌，分析原因，可能是表皮微生物中的其他菌群促进了β-熊果苷的分解。同时本文通过模拟药物稳定性的加速实验，研究了高温高湿（40 ℃，75%湿度）条件对β-熊果苷原料、以及添加 了维生素C和珍珠粉后的β-熊果苷原料复配物稳定性的影响，发现β-熊果苷原料在不同温度、湿度下均很稳定，添加了维生素C和珍珠粉的β-熊果苷的稳定性会降低。

3 结论

本文通过高效液相色谱法检测β-熊果苷水溶液及含有β-熊果苷的粉剂类样品中是否产生氢醌，来分析β-熊果苷稳定性。结果表明，β-熊果苷水溶液在pH=5，温度为40 ℃时相对比较稳定，pH=3时相对不稳定，且随着放置时间的延长，β-熊果苷分解产生的氢醌越多。同时研究发现表皮葡萄球菌不会导致β-熊果苷分解产生氢醌。表皮细胞会促进β-熊果苷的分解，且随着β-熊果苷含量的增加，分解产生的氢醌越多。进一步研究发现β-熊果苷原料在不同温度、湿度下均很稳定。在β-熊果苷中加入维生素C，珍珠粉等，β-熊果苷的稳定性会降低。这一研究对原料储藏、β-熊果苷在化妆品中使用的添加量以及复配物的选择有一定的指导意义。