HPLC测定儿童化妆品中10种邻苯二甲酸酯类化合物的含量

杨永超，闫 婧，赵好力宝，李学洋，张 园，周 磊

（天津出入境检验检疫局工业产品安全技术中心，天津 300308）

邻苯二甲酸酯（PAEs）为邻苯二甲酸的酯化衍生物，由于其良好性能和成本低廉，被广泛用于食品包装袋、玩具、纺织品和医疗设备等产品中［1-4］，同时，作为塑型剂和定香剂也被广泛添加于化妆品中［5,6］，如香水、指甲油、头发喷雾剂、洗涤用品等，可增加护肤品柔顺感，降低指甲油脆性，减少香气成分的过度挥发，用在发胶中可避免头发僵硬等。研究［7-9］表明，PAEs可干扰人体的内分泌系统，其毒性是三聚氰胺的20倍。PAEs已被列为主要的环境雌激素，是世界上最广泛存在的污染物之一。人类与化妆品接触的亲密程度仅次于食品，PAEs通过与人类脸部、头发、四肢等皮肤接触直接被吸收，长期接触会在人体残留并带来相应的危害［10,11］。鉴于PAEs的危害，各国及组织陆续出台相应政策法规和限量规定。化妆品方面，美国商品标签法案明确要求，若化妆品中添加了PAEs必须在标签中明确标出。欧盟的化妆品指令EC No.1223/2009和我国的《化妆品安全技术规范》（2015年版）（以下简称《规范》）［12］都禁止在化妆品中使用该类物质。然而，现有法规仅仅涉及到了7种PAEs，尽管常用的邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）被禁止使用，但是其他PAEs，例如邻苯二甲酸二乙酯（DEP）则没有使用限制，而且有文献［13-15］报道其检出率较高。

目前对PAEs主要采用气相色谱（GC）、气质联用（GC-MS）、液相色谱（HPLC）和液质联用（LC-MS）等手段进行检测［13-20］，但是相对而言，GC-MS和LC-MS造价较高，实验室普及率较低。GC法和HPLC法相比较，HPLC法更稳定，分析灵敏度、精密度、准确度和重现性都更好，故实验采用低成本的HPLC检测技术。相比较于成人而言，儿童更容易吸收PAEs物质，也更易受到伤害，因此，建立儿童化妆品中PAEs检测方法，对保护儿童健康具有重大意义。基于此，本文以高效液相色谱-二极管阵列（HPLCDAD）为检测仪器，建立同时测定儿童化妆品中10种PAEs化合物含量的方法。相比于《规范》收录的检测方法，该方法对流动相进行了优化，极大的提高了10种PAEs的分离度。同时HPLC法容易出现假阳性现象，方法采用全波长扫描（190～800 nm）、加标对照和改变流动相的方式对疑似阳性样品进行确证，3种确证方式联合使用，可替代成本较高的MS类检测器的使用。

1 实验部分

1.1 主要试剂和仪器

10种PAEs分别为邻苯二甲酸二甲酯（DMP，CAS No.131-11-3）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP，CAS No.84-66-2）、邻苯二甲酸二正丙酯（DPP，CAS No.131-16-8）、邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP，CAS No.84-74-2）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP，CAS No.131-18-0）、邻苯二甲酸二正戊酯（DAP，CAS No.84-75-3）、邻苯二甲酸二环己酯（DCHP，CAS No.85-68-7）、邻苯二甲酸二正己酯（DHP，CAS No.84-61-7）、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP，CAS No.117-84-0）和邻苯二甲酸二正辛酯（DOP，CAS No.117-81-7），均购自德国Dr.Ehrensorfer公司；甲醇，色谱纯，美国Grace公司。

Ultimate 3000SD高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（DAD），美国Thermo Fisher公司；S 30H型超声波清洗机，德国Elma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC条件

色谱柱：AcclaimTM120-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速为1 mL/min；柱温：室温；检测波长：280 nm；进样体积5.0 μL。流动相梯度洗脱程序见表1。

表 1 梯度洗脱程序表Tab.1 The details of stepwise mobile phase gradient elution

1.2.2 标准储备液配制

分别准确称取上述10种PAEs 10 mg （精确至0.1 mg）于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成质量浓度为1.0 g/L的标准溶液；每种标准溶液分别移取1.0 mL至10 mL容量瓶中，得质量浓度为100 mg/L的10种PAEs的混合标准储备液。

1.2.3 样品制备

油状样品处理：称取样品1 g （精确至0.001 g）于10 mL具塞刻度管中，加入正己烷至刻度，混匀，超声提取20 min，每5 min晃动一下，5 000 r/min离心5 min。经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。

非油状样品处理：称取样品1 g （精确至0.001 g）于10 mL具塞刻度管中，加入甲醇至刻度，混匀，超声提取20 min，每5 min晃动一下，5 000 r/min离心5 min。经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液备用。

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择

考察了甲醇、正己烷、乙腈的萃取效率。实验表明，对于油状样品，正己烷的萃取效率更高，而对于非油状样品，甲醇的萃取效率更高，因此，对于油状样品，选用正己烷为提取剂，对于非油状样品，则选用甲醇为提取剂。

2.2 萃取时间的选择

考察了萃取时间（5，10，15，20和25 min）对4大类化妆品样品中BBP的萃取效率的影响。对于油状样品，5～20 min萃取效率逐步提升，20 min基本提取完全；对于非油状样品，15 min后，提取效率无变化。为保证达到最大提取效率，萃取时间定为20 min。

2.3 流动相的选择

考察了不同流动相的分离效果（图1）。图1a采用《规范》中收录的方法，流动相是甲醇和水，化合物4和5，6和7的分离度较低，基线也不平稳。图1b流动相为甲醇、水、乙腈，大大改善化合物4和5，6和7的分离度，并且基线也更平稳，因此，选择甲醇、水、乙腈组成的三元流动相。

2.4 线性范围

精密量取混合标准储备液，以甲醇稀释，得到10种PAEs质量浓度均为1，5，10，25，50和100 mg/L的系列混合标准溶液。上机测试，记录10种PAEs化合物的峰面积，每个质量浓度点测试3次，取平均值。以质量浓度（x，mg/L）为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性回归。得到的回归方程如表2所示。结果显示，10种PAEs在1～100 mg/L范围内线性良好。

表 2 10种PAEs在1～100 mg/L范围的线性回归方程和相关系数Tab.2 Li near regression equations and correlation coefficients for 10 PAEs in the level range of 1-100 mg/L

2.5 检出限、定量限和检出浓度、最低定量浓度

采用逐级稀释标准溶液方法进样，信噪比（S/N）为3时的样品浓度即为检出限；S/N为10时的样品浓度即为定量限。本方法10种PAEs的检出限、定量限以及检出浓度、最低定量浓度（取样量为1.0 g，定容体积为10 mL）见表3。

表 3 各组分的检出限、定量限、检出浓度和最低定量浓度Tab.3 The LOD， LOQ， lowest detective and quantitative concentrations for 10 PAEs

2.6 回收率和精密度

分别称取3种阴性化妆品样品（水状、霜乳状、油状）各6份（n=6），每份添加2.0 mL混合标准品（100 mg/L），即标准品添加量为200 μg，按照“1.2.3”项下的方法制备样品（定容至10 mL，即质量浓度为20 mg/L），上机测试，结果见表4。实验结果表明，10种PAEs的添加回收率在89.2%～106.1%之间，表明加标回收实验结果良好。测定结果的RSD均小于5%，该方法准确度和精密度良好。

表 4 10种PAEs的添加回收实验结果（n=6）Tab.4 Recovery results of 10 PAEs （n=6）

2.7 样品检测

2.7.1 市售样品检测

取市售8种化妆品样品，按“1.2.3”项下的方法制备样品上机测试，测试结果如表5所示，8种样品中2#样品检出DEHP，含量为6 573.6 μg/g，证明市场上化妆品确实存在风险。

表 5 8种样品检测结果Tab.5 Test results of 8 commercial samples

2.7.2 阳性样品确证

1）图谱对照：数据采集过程中采用全扫描方式（190～800 nm），提取2#样品中检出物质DEHP的紫外图谱和标准物质DEHP的紫外图谱进行对比，见图2（见下页）。二者的紫外吸收图谱基本一致，因此，判断2#样品为阳性。

2）加标对照：采取了加标对照的方式，验证2#样品为阳性。详见图3a和图3b（见下页），其中曲线a为2#样品进行适当稀释；曲线b为稀释后的2#样品溶液加入同等浓度的标准溶液。由图3中可见，曲线a和b的出峰完全重合，且加标后样品的峰面积基本为加标前的2倍，因此，进一步推断2#样品为阳性样品。

3）改变流动相：为进一步验证阳性样品的准确性，采取了加大流动相的极性，详见图3c和图3d（见下页），其中曲线c为DEHP的标准溶液；曲线d为稀释后的2#样品溶液加入同等浓度的标准溶液。流动相极性改变后，曲线c和d的出峰时间一致，并且曲线d没有出现峰分裂的现象，证明2#样品中检出物质与添加的标准物质为同一物质，证明2#样品为阳性。

3 结论

建立了测定儿童化妆品中10种PAEs的HPLC-DAD方法。该方法线性范围广，精密度良好，灵敏度高，可满足化妆品检测要求。该方法应用于市售8种化妆品的检测，并通过紫外图谱比对、加标实验以及改变流动相3种方式对阳性样品进行了确证，结果表明确实为阳性样品，这也表明我国化妆品市场上风险是存在的，化妆品市场监管有待加强。