城步峒茶资源主要生化成分遗传多样性分析

宁 静，刘 振，杨拥军，杨 阳*，沈程文，张曙光*，肖敦旺，马良元

（1.湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南农业大学 园艺园林学院 茶学系，湖南长沙 410128；3.城步县农业局，湖南 城步 422500；4.城步天仁大峒茶业有限公司，湖南 城步 422500）

茶树[Camellia sinensis(L.) O.Kuntze]种质资源是茶树种质创新、品种选育、生产利用的物质基础，合理选用优良种质是提高育种成效的技术关键之一[1]。城步峒茶原产于湖南省城步县境内，是湖南四大典型地方茶树群体资源之一。陈兴琰等[2]、陈国本[3]、石林[4]认为，城步峒茶是茶树由原始乔木型向灌木栽培型驯化的重要见证，是湖南四大茶树地方群体资源中与云南大叶种亲缘关系最近的类型。张贻礼和胡万选[5]、黎星辉等[6]研究认为，峒茶属南方型大叶茶树，适制红碎茶，内质优异，风格独特。袁春华等[7]对城步峒茶植株、树型、树姿、叶片和花器官等形态特征进行研究，认为城步峒茶产地可能是茶树原产地的“尾声”区域。因此，收集、保存、鉴定、评价和开发利用城步峒茶种质资源对于湖南茶产业的发展具有十分重要的意义。

茶树鲜叶中的生化成分组成及含量决定了茶叶品质的优劣以及名优茶的适制性，从而决定了茶树品种资源的利用价值和开发效益[8-10]。可见，对茶叶品质成分进行测定分析是研究茶树品种资源特性、筛选优异茶树资源和对资源进行开发利用的基础。而目前对城步峒茶资源主要生化成分的多样性分析尚未见研究报道。本试验以17份有代表性的城步峒茶单株为研究对象，在同一生境下进行鉴定评价，分析研究其主要生化成分的遗传多样性，并从中发掘出一些特异资源，为深入研究与利用城步峒茶资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以城步县境内城步峒茶群体种质资源为研究对象，经现场考察后根据形态差异收集17份有代表性单株（表1），其中青叶峒茶10份，黄叶峒茶7份。

1.2 测定方法

参照陈亮等[11]编写的《茶树种质资源描述规范和数据标准》的方法，在春季采摘第1 轮新梢的一芽二叶制作生化样，用于生化成分测定。水浸出物含量测定参照GB/T 8305-2013；茶多酚含量测定参照GB/T 8313-2008；氨基酸总量测定参照GB/ T8314-2013；咖啡碱含量测定参照GB/T 8312-2013；儿茶素单体测定采用液相色谱法。

表1 17份城步峒茶资源的基本情况Table 1 Basic data of 17 Chenbu Dong Tea plant germplasms

1.3 统计分析

基本统计数据和生化成分多样性指数分析采用Excel 进行，主成分分析和聚类分析通过 SPSS 21.0 统计软件进行。主成分分析采用Factor 过程的 Varimax (方差最大化正交旋转)，对各变量进行方差最大化正交旋转，提取累计贡献率大于85% 的主成分[12]。聚类分析采用离差平方和法（Ward′s method），平均欧氏距离。多样性指数的计算采用 Shannon-Weave 信息指数[13]，即（H′）=-∑PilnPi，其中Pi为某性状第i个代码出现的频率。计算遗传多样性指数（H′）前先对数量性状进行质量化处理，对数值性状进行10 级分类：1 级＜-2s，10 级≥+2 s，中间每级差 0.5 s，为平均数，s 为标准差。

2 结果与分析

2.1 主要生化成分表现和遗传多样性分析

由表2 可以看出，17份城步峒茶资源的生化成分平均遗传多样性指数（H'）为2.34，变化范围为1.63%～2.78%，表现出丰富的生化多样性。15个指标中，遗传多样性指数最大的是EC，达 2.78，说明EC 含量在城步峒茶种质中多样性较广泛，所包含的信息量较大；其次为咖啡碱和EGCG 含量，分别为2.72 和2.65；最小为水浸出物含量，仅为1.63。

变异系数是衡量各观测值变异程度的一个统计量[14]。在影响茶叶品质的4 项常规生化成分（水浸出物、氨基酸、茶多酚、咖啡碱）中，变异系数最大的是咖啡碱，达20.04%；其次是氨基酸和酚氨比，分别为17.48%和17.18 %；最小的是水浸出物，仅为3.27%，说明这4个成分中，咖啡碱和氨基酸的改良潜力较大，而水浸出物的改良潜力最小。水浸出物含量最高的是HD1806（43.64%），最低的是QD1808（40.98%），平均为40.98%；82.35%的资源水浸出物含量超过40%，说明城步峒茶内含物质丰富。茶多酚含量最高的是QD1807（35.10%），最低的是QD1801（27.62%），平均为31.14%，茶多酚含量＞30%的单株11个，占资源的64.71%，其中＞35%的单株2个：QD1807（35.10%）和HD1802（35.05%），可筛选为高茶多酚资源。氨基酸含量最高的是QD1803（4.00%），最低的是QD1801（2.18%），平均为3.07%，47.06%的资源氨基酸含量低于3%。咖啡碱含量最高的是HD1804（5.74%），最低的是HD1807（2.39%），平均为4.14%，咖啡碱含量＞4.00%的单株有11个，占资源的64.71%，属于较高咖啡碱茶树资源，其中＞5.00%的单株有两个：QD1810（5.11%）和HD1804（5.74%），为高咖啡碱茶树资源。

酚氨比是一个体现茶树资源适制性的生化指标，酚氨比小于8，一般适制绿茶，酚氨比在8～15 之间为红绿茶兼制型，酚氨比大于15，一般适制红茶[15]。城步峒茶资源酚氨比变幅为7.67%～13.43%，平均为10.28%，以HD1803 最高，QD1803 最低。其中只有1份资源的酚氨比小于8，其余资源的酚氨比均在8～15 之间，具有红绿茶兼制特性，占资源的94.1%。

儿茶素是茶叶保健功能的主要成分，其含量和组成与茶叶品质密切相关，也是体现茶树资源进化类型的一个重要指标[16]。由表2 可以看出，17份城步峒茶资源的儿茶素组分含量整体变异系数较大，资源变异类型较多，在育种上的选择范围大。非酯型儿茶素的变异系数高于酯型儿茶素，变异系数最大的是EGC 的含量，达到 52.23 %，其次是 EC 和 C，而且在体现茶树进化程度的EC 和C 占整个儿茶素的比例上，城步峒茶资源也包含丰富的类型，高的达到10.54 %，低的仅为2.33 %，存在丰富的变异(CV=30.48 %)，说明城步峒茶资源在进化程度上存在丰富的多样性，既具有比较原始的类型，也有进化程度较高的类型。17份资源中，儿茶素总量＞17%有1份（HD1802），酯型儿茶素＞12%的资源有2份（QD1807 和HD1806）。

表2 主要生化成分的基本统计参数和遗传多样性指数Table 2 Basic statistical parameters and genetic diversity index of main biochemical composition

2.2 生化成分的主成分分析

主成分分析能够较好地解释群体方差的主要来源，从而获得解释方差的重要性状并简化研究性状，以利于更好地研究群体[17]。以 17份资源15个生化成分为变量，以累积贡献率≥85%为标准，确定了 4个主成分（表3）。结果发现，前4个主成分的累计贡献率达85.20%，这4个主成分包含了所有性状的大部分信息，可以用来对材料进行综合评价[18]。第1 主成分贡献率达到29.76%，贡献最大的是酯型儿茶素和EGCG，其次是茶多酚和儿茶素总量，反映的主要是酯型儿茶素含量的信息；第 2主成分贡献率达到29.29%，贡献最大的是非酯型儿茶素，其次是GC 和EGC，反映的主要是非酯型儿茶素含量的信息。第3 主成分贡献率达到15.18%，贡献最大的是负值的氨基酸含量，其次是酚氨比，反映的主要是酚氨比的信息；第4 主成分贡献最大的是C，其次是GCG。

2.3 城步峒茶资源的聚类分析

根据15个生化成分数据，将17份城步峒茶资源进行聚类分析（图1），同时根据聚类的结果比较分析了各类群生化成分的差异（表4）。

由图1可知，当在遗传距离为10 时，可以将17份城步峒茶资源聚为3个类群。其中有8份峒茶资源聚到第Ⅰ类群中，并分为2个亚群：QD1810、HD1804、QD1807、QD1803、QD1804 和QD1802为一个亚群；HD1802 和HD1806 为一个亚群。第Ⅱ类群包括5份峒茶资源：QD1805、HD1801、QD1808、QD1809 和HD1807。第Ⅲ类群包括4份峒茶资源：QD1801、HD1805、QD1806 和HD1803。

由表4可知，三个类群除了水浸出物含量不存在显著差异外，其他各生化成分均有显著的差异。第Ⅰ类群的水浸出物、茶多酚和氨基酸含量是三个类群中最高的，酚氨比10 左右，属红绿茶兼制型；第Ⅱ类群茶多酚含量较高，氨基酸含量较高，酚氨比9 左右，也是红绿茶兼制的资源；第Ⅲ类群的茶多酚含量较高，氨基酸含量较低，酚氨比大于12，是适制红茶的资源。从总体上看，三个类群的资源茶多酚含量（＞29%）都较高，氨基酸含量＜4%，酚氨比均大于8，说明城步峒茶大部分资源适制红茶。

图1 城步峒茶资源的聚类分析Fig.1 Dendrogram of 17 Chenbu Dong Tea germplasm resources

2.4 特异种质资源的筛选

在茶叶深加工中功能性成分的提取和高含量功能性成分茶产品的生产过程中，生化成分含量特异的茶树种质往往是其生产的重要原料来源，同时该类种质可以作为杂交育种的亲本用于今后育种的研究[19]。本研究根据生化成分测定结果，参照《农作物优异种质资源评价规范-茶树》（NY/T 2031-2011）相关指标及有关文献，从17份城步峒茶资源中初步筛选出21份生化成分特异的种质，还有一批潜在的优良资源，详见表5。这些特异资源可以作为育种亲本用于今后的育种研究或者直接利用。

表5 生化成分含量特异的资源Table 5 Some special germplasms on biochemical compositions

3 讨论

通过对筛选的17份资源进行系统鉴定评价，发现城步峒茶资源的主要生化成分存在较高的遗传多样性，平均多样性指数达到2.34。变异类型比较丰富，在很多成分上变异系数较高，有很大的选择潜力。另一方面，从本研究结果可以看出，城步峒茶资源既有进化上比较原始的类型（EC 和C 的比例较高），也有进化程度较高的类型（酯型儿茶素比例高），这可能与城步苗族自治县与广西壮族自治区龙胜县接壤，而桂西北地区属于西南茶区，毗邻茶树的起源中心，在自然环境上与其相似，可能是茶树的次生中心之一[20]，在茶树资源的分布上，蕴藏着一些进化程度较低的类型，而其他地方的资源则在进化程度上较高，所以在生化成分的分布上表型比较丰富。

15个生化成分变量表现出连续性变异，变异幅度和变异系数均较大，平均变异系数达24.43 %，比相邻近的广西(25.80 %)[21]、四川(26.80 %)[22]偏低，而比云南(16.53 %)[23]偏高。在17份资源中，水浸出物、茶多酚、氨基酸和咖啡碱含量的平均值分别为 40.98%、31.14%、3.07%和 4.14%。与广西、四川、云南茶树资源茶多酚含量、咖啡碱含量相比偏高。本研究中，水浸出物含量最高达43.64%，最低为37.67%，有82.35 %的资源超过40%，说明城步峒茶内含物质丰富；茶多酚含量最高为35.10%，最低为27.62%，有64.71%的资源大于30%，属于高茶多酚资源；氨基酸含量最高为4%，最低为2.18%，有47.06%的资源低于3%；咖啡碱含量最高为5.74%，最低为2.39%，有64.71%的资源大于4%，属于高咖啡碱资源。杨亚军[9]、陆锦时等[24]的研究结果认为，适制红茶的品种氨基酸含量相对较低，茶多酚、儿茶素、水浸出物和咖啡碱含量较高，酚氨比高。根据这个标准，城步峒茶大部分资源适制红茶。

表4 不同类群的主要生化成分比较Table 4 Comparision of main biochemical components of different groups

根据 17份资源 15个生化成分变量分析，前4个主成分累计贡献率达85.197%，保留了15个生化成分的信息。其生化因子对品质的贡献依次为：酯型儿茶素构成因子＞非酯型儿茶素构成因子＞酚氨比构成因子。第 1 主成分中贡献率最大的为酯型儿茶素（0.912）和EGCG（0.889），表明在所分析的15个生化成分中酯型儿茶素和EGCG 对茶叶品质的影响较大。从各主成分对品质育种有价值的入选材料应是第1主成分因子适中偏大，第 2、第3 主成分适中，第4 主成分适中偏小。

聚类分析将17份资源划分为三大类群，每个类群的生化成分存在较大差异，决定了适制性不同。酚氨比是判定茶树资源适制性的一个指标，一般认为酚氨比小于8 适制绿茶，大于15 适制红茶。而新标准GB/T 8313-2008 测得，茶叶茶多酚含量比 GB/T 8313-2002 标准降低了30%～40%[25-27]；本研究认为，采用 2008 相关标准检测茶多酚和氨基酸以杨亚军等[28]认为酚氨比小于7 适制绿茶，大于10 适制红茶较为实际。因此，在此次17份资源中，按照此数值进行比较，适制绿茶资源只有1份，红绿茶兼制型资源7份，适制红茶资源9份。依据这些标准，第Ⅰ、Ⅱ类群为红绿茶兼制型，第Ⅲ类群则为适制红茶型。分类结果与实际结果大致相符。

通过系统的鉴定评价，初步筛选出一批生化成分优异的资源。17份资源的茶多酚含量均≥25%，属高茶多酚特异资源；选出咖啡碱含量大于4%的潜在优异资源11份，其中QD1810和HD1804 为咖啡碱≥5%的特异资源；选出儿茶素含量大于17%的资源1份：HD1802，酯型儿茶素大于12%的资源2份：QD1807 和HD1806。这些资源在某一成分或几个成分上（如QD1807、HD1802 和QD1810 等）具有较高的含量，对这些优异资源进行深入研究，可以在深加工上直接利用或为今后茶树杂交育种提供新的亲本材料。