MTHFR、GSTP1、MSH3和ABCG1单核苷酸多态性与结直肠癌辅助化疗疗效和不良反应的相关性研究

张钟予， 马一杰， 邓文英， 韩雪灵， 杨欣怡， 李 燕， 李 宁， 罗素霞

郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院 1.消化内科； 2.药学部，河南 郑州 450000

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是我国常见的消化道恶性肿瘤，与发达国家相反，在过去几年中我国CRC发病率和死亡率呈上升趋势[1]。目前，手术切除仍是CRC患者的首选治疗手段，然而对于Ⅱ/Ⅲ期和可切除Ⅳ期CRC患者，单纯手术往往无法取得良好的效果，术后辅助化疗地位日益重要。目前，奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物是公认的辅助化疗方案[2]，但不同个体间在疗效、不良反应发生方面有显著性差异。目前，从药物基因组学角度研究患者之间药物敏感性和预后的差异是研究的热点。通过寻找具有预测价值的遗传预测指标，对于指导个体化治疗、减少严重不良反应发生、改善患者预后具有重要意义。

既往研究[3]表明，编码药物代谢酶、DNA修复酶、解毒途径和转运蛋白的基因存在单核苷酸多态性(SNPs),影响化疗药物在体内的代谢过程，是导致个体间差异的原因之一。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是氟尿嘧啶类药物体内代谢的关键酶之一[4]，谷胱甘肽S转移酶P1(GSTP1)参与DNA修复及代谢毒物，与铂类耐药相关[5]，DNA错配修复基因3(MSH3)与铂类药物化疗敏感性相关[6]，而多药耐药相关蛋白(ABCG1)作为多种药物转运蛋白，与多种药物耐药相关[7]。本文旨在通过检测上述4个基因的多态性，探究其在接受术后辅助化疗的R0切除CRC患者中的预测价值，探索潜在预测指标，为个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2010年8月至2012年3月于我院行R0切除CRC患者42例，年龄23～78岁(中位年龄为54岁)，所有病例均符合：(1)经病理学检查确诊；(2)年龄≥18岁；(3)美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体力状况评价0～2分；(4)有足够的骨髓功能储备，心、肝、肾、肺等重要脏器功能正常。排除标准：(1)家族性腺癌性息肉病；(2)其他遗传性CRC综合征；(3)合并其他系统肿瘤；(4)术前行新辅助化疗；(5)失访患者。42例病例基本特征见表1。

续表1

临床特征例数/%化疗方案 mFOLFOX634(81.0) XELOX8(19.0)MTHFR-rs1801131 AA34(81.0) AC6(14.3) CC2(4.7)GSTP1-rs1695 AA28(66.7) AG10(23.8) GG4(9.5)MSH3-rs863221 TT20(47.6) TG16(38.1) GG6(14.3)ABCG1-rs425215 GG23(54.8) GC16(38.1) CC3(7.1)

1.2方法

1.2.1 治疗方案：采用mFOLFOX6/XELOX方案化疗。mFOLFOX6：奥沙利铂85 mg/m2第1天静滴；亚叶酸钙400 mg/m2第1天静滴；5-氟尿嘧啶400 mg/m2第1天静推，2 400 mg/m2持续静滴46 h 2周方案。XELOX：奥沙利铂130 mg/m2第1天静滴；卡培他滨850 mg/m2第1～14天口服，2次/d，3周方案。结合患者情况，给予术后辅助化疗方案6～8个周期，根据化疗期间出现的血液学及非血液学不良反应调整用药剂量，若出现严重不良反应立即终止治疗。本研究经河南省肿瘤医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2.2 标本采集：收集42例患者化疗前静脉血各2 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，室温静置30 min，-80 ℃保存。

1.2.3 检测方法：使用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，DP304)提取血液标本基因组DNA，并严格按照试剂盒说明书的规定操作。采用PCR法对MTHFR-rs1801131、GSTP1-rs1695、MSH3-rs863221和ABCG1-rs425215四个基因位点扩增，扩增后产物使用ABI 3370XL DNA测序仪通过Sanger法对上述基因位点进行等位基因分析，引物序列由北京金唯智生物科技有限公司合成并严格按照说明书标准进行操作。设置阴性对照，部分标本的分型结果通过酶切法进行验证。

1.2.4 临床疗效及不良反应评价：接受R0切除CRC患者无可测量病灶，我们通过定期复查或电话联系对入组患者进行随访，以无病生存时间(DFS)作为评估AC疗效的主要指标，以总生存期(OS)作为评估次要指标。DFS是指从手术当天至肿瘤复发、转移、肿瘤引起的死亡之间的时间，5年尚未复发或非肿瘤所致死亡做截尾处理者；OS是指从病理确诊直至肿瘤引起的死亡或至随访终点的时间。在每周期化疗前后行血液学检验，并详细询问化疗期间有关食欲、恶心、呕吐、腹泻和手足麻木的情况，根据NCI-CTC标准(2.0版)对患者每周期化疗中所出现的不良反应进行评估并记录。

1.3统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，使用GraphPad Prism5软件绘制图表。计数资料以例数/%表示。不同基因型与DFS和OS采用Kaplan-Meier法进行分析，并进行Log-Rank检验。基因型与化疗方案疗效及不良反应的关系采用χ2、Fisher确切概率法检验。对DFS和OS构建Cox风险比例模型校正混杂因素，进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1基因多态性与化疗相关不良反应的相关性分析根据NCI-CTC标准(2.0版)，54.8%的患者(23/42)在化疗期出现Ⅱ度及以上化疗相关不良反应，Ⅲ～Ⅳ度不良反应少见，考虑到Ⅱ度及以上不良反应发生的普遍性和临床相关性，本部分研究主要将Ⅱ度及以上不良反应作为主要研究指标。其中，血液学毒性(45.2%，19/42)是最常见的不良反应，其次为手足麻木(周围神经毒性)，占40.5%(17/42)，而仅有16.7%(7/42)的患者发生Ⅱ度及以上胃肠道不良反应。

通过χ2检验对基因型与不良反应发生率进行的关联性分析(见表2)，我们发现， GSTP1-rs1695的多态性与消化道不良反应发生率有显著相关性：GSTP1-rs1695 AA型发生Ⅱ度及以上消化道不良反应的概率显著高于突变型(AG/GG型)，差异有统计学意义(25.0%和0，P=0.040)。其他3个位点基因型与不良反应发生率之间无显著相关性(P>0.05)。

表2 CRC患者SNPs与Ⅱ度以上不良反应之间的相关性分析

2.2基因多态性与术后辅助化疗疗效分析入组患者的中位随访时间为33.6个月(2.2～60个月)。随访结束时，10例(23.8%)患者无复发和转移，31例(73.8)患者仍存活，7例(16.7%)死于CRC，4例(9.5%)失访。

通过K-M生存分析不同位点各基因型与DFS和OS进行的相关性，将结果总结在表3和图1、2中。基于K-M分析，MTHFR-rs1801131的野生型(AA)与突变型(AC/CC)在DFS和OS上比较，差异有统计学意义(P<0.05)，AC/CC型患者的DFS和OS显著短于AA型患者(6.5个月vs25个月，P=0.012；15.2个月vs44.7个月，P=0.010)。存在GSTP1-rs1695突变(AG/GG)的患者较野生型(AA)患者的DFS短，但差异仅达边缘统计学意义(25.0个月vs12.7个月，P=0.087)。然而，在MSH3-rs863221、ABCG1-rs425215两个位点，基因型分布与生存之间无明显相关性。

此外，本研究通过构建Cox风险比例模型校正混杂因素，进行多因素分析(见表4)。经单因素分析发现,病理分期对患者生存有影响(P=0.037),因此将病理分期和MTHFR-rs1801131纳入模型。经校正，MTHFR-rs1801131对DFS和OS独立的影响意义仍存在，差异有统计学意义(P<0.05)。可以认为，MTHFR-rs1801131 A>C突变是对R0切除CRC患者接受标准术后辅助化疗预后判断的独立预测因子。

表3 CRC患者SNPs与预后的相关性分析

图1 不同基因型CRC患者术后DFS比较;图2 不同基因型CRC患者术后OS比较Fig 1 Comparison of DFS patients with different genotypes of CRC; Fig 2 Comparison of OS patients with different genotypes of CRC

因素DFSOS单因素分析P值多因素分析P值RR(95% CI)单因素分析P值多因素分析P值RR(95% CI)性别0.375——0.502——化疗方案0.185——0.069——年龄0.306——0.493——病理分期0.0370.1151.84(0.861～3.953)<0.001 0.0402.540(1.044～6.177)部位0.438——0.386——MTHFR A>C0.0120.013a3.426(1.128～9.046)0.0100.007a3.385(1.389～8.253)

注：DFS；无病生存期；OS；总生存期；CI：置信区间；RR：风险比；a:校正分期。

3 讨论

在R0切除的Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ期CRC患者中，很大比例将会出现术后原位复发和远处转移。术后早期行辅助化疗是消灭微小病灶、是保证疗效、延长DFS、提高治愈率的重要治疗手段。目前，奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物是公认的标准辅助化疗方案，而临床上发现相同病理类型的患者接受相同的化疗方案，患者不良反应的发生率和预后相差很大，该现象无法完全用年龄、性别、病理分期解释。随着药物基因组学的发展，人们逐渐认识到相关药物代谢相关酶基因多态性是该现象的根本原因之一[3]。基因多态性包括DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性和单核苷酸多态性，其中最主要的是SNPs。通过检测药物代谢相关基因SNPs，可以预测术后辅助化疗疗效和不良反应的发生情况，为个体化治疗提供理论依据。目前，绝大多数关于SNPs与CRC的研究局限于不同基因型与发病之间的关系及其与晚期CRC化疗疗效之间关联的研究，关于SNPs在术后辅助化疗中的临床意义研究较少，且争议较大[8-9]。本研究通过对尚存争议和研究较少的4个位点进行分析，结果验证了MTHFR-rs1801131和GSTP1-rs1695多态性在接受术后辅助化疗的CRC患者中具有预测价值。

5-FU是消化道恶性肿瘤最基础和常用的化疗药物，在此基础上研发出了口服氟尿嘧啶前药卡培他滨、替吉奥，这些药物均可在体内转化代谢为5-FU从而发挥疗效。5-FU在体内经一系列酶促反应转化为活性代谢产物5-氟尿嘧啶脱氧核昔(FdUMP)，FdUMP在辅因子5，10-亚甲基四氢叶酸(CH2FH4)的存在下，能与胸苷酸合酶(TS)结合形成等价的三连复合物TS-FdUMP-CH2FH4，影响TS与dUMP的结合，使TS失去催化活性，从而抑制了dTMP的合成，使DNA合成受限，导致细胞生长受到抑制甚至死亡，达到减灭癌细胞的目的[10]。MTHFR是5-FU体内代谢过程中的关键酶之一，MTHFR-rs1801133和MTHFR-rs-1801131是常见的突变位点，基础研究结果认为该两位点突变与MTHFR酶活性下降有关，导致叶酸代谢障碍，使5，10-亚甲基四氢叶酸积聚，可能会增加5-FU利用度[11]。本研究结果提示，MTHFR-rs1801131突变型是R0切除术后接受标准辅助化疗预后差的独立预测因素，但该位点多态性与化疗相关不良反应的发生率之间无明显相关性。CECCHIN等[12]研究发现，相较于MTHFR-rs1801131AA+AC型，CC型患者有较差的预后,这与我们的研究结果相一致；然而也有部分研究与本研究结果相反，如NAHID等[13]研究表明，MTHFR-rs1801131多态性与化疗预后无确切关联。

奥沙利铂是第3代铂类化疗药，在体内通过与细胞DNA结合，形成Pt-DNA复合物，干扰DNA的功能，从而发挥抗肿瘤作用[14]。GSTP1是体内谷胱甘肽转移酶的(GSTS)亚型之一，具有促DNA修复作用，且与化疗药物代谢有关。GSTP1-rs1695位点的腺嘌呤A突变成鸟嘌呤G，导致第105位密码子编码的氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸，使GSTP1修复DNA损伤酶活性降低及奥沙利铂排泄速率降低。据此我们猜想存在GSTP1-rs1695突变的患者可能对辅助化疗反应更佳，而发生化疗相关不良反应率更高。然而，与我们推测相反的是，本研究中我们发现，GSTP1-rs1695野生型患者的Ⅱ度及以上胃肠道不良反应发生率远高于突变型型，与YUAN等[15]的研究结果相一致。目前，GSTP1突变与化疗敏感性、预后的关系暂无定论，HOLLEY等[16]研究发现，接受mFOLFOX6化疗的329例CRC患者，GSTP1突变与预后无关，这与我们的结果相似。而KUMAMOTO[17]研究表明，GSTP1 AG/GG基因型较AA型对FOLFOX敏感性高。

MSH3是一种DNA错配修复蛋白，MSH3和MSH2形成的异源二聚体MutSβ，一方面参与识别DNA链的核苷酸错配修复，在维持基因组完整性和稳定性方面具有重要作用。另一方面，MutSβ参与了识别修复DNA-DNA链间交链结构(ICLs)，这一结构形成是化疗药物如顺铂作用肿瘤细胞的重要机制[18]。ABCG1是多药耐药相关蛋白，是一类ATP能量依赖型跨膜转运蛋白，是具有选择性和特异性的药物外排泵，与多种药物耐药相关[7]。LIU等[6]发现MSH3部分位点与铂类药物不良反应相关；WANG等[19]对1 185例非小细胞肺癌患者进行分析发现，ABCG1部分位点与预后相关。在本研究中，MSH3-rs863221及ABCG1-rs425125 多态性与化疗不良反应的发生及预后无明显相关性。

本研究结果提示，MTHFR-rs1801131和GSTP1-rs1695多态性在接受术后辅助化疗的CRC患者中具有预测价值，可能作为R0切切除CRC患者术后辅助化疗的独立预测指标，用于指导个体化用药。然而，本研究有部分局限性，样本量较小，可能存在偏移，应扩大样本量进一步研究。